分享基于碳量子点

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本发明涉及一种金属硫蛋白的检测方法,特别是涉及一种利用碳量子点-金纳米粒子体系定量检测金属硫蛋白浓度的方法。



背景技术:

金属硫蛋白(mts)是一种低分子量(mr<10kda)、富含半胱氨酸的金属结合蛋白,广泛存在于多种动物、高等植物、微生物和人类的各种组织和器官中。因其具有易与重金属结合的特性,在重金属解毒、清除自由基、调节细胞内平衡和维持金属离子浓度的稳态方面起着重要作用。此外,mts还与身体的生长、发育以及某些疾病等生理过程有关。

基于mts对重金属污染的响应能力,以及水生动物体内mts含量与环境重金属污染程度之间的统计相关性,mts被认为是环境中重金属污染的潜在生物标志物。其他研究发现,人类尿液中的mts含量与重金属引起的环境污染程度之间也存在着显著的统计学相关性。因此,mts作为重金属污染生物标志物的相关研究已成为环境科学、生物科学以及毒理学等领域的研究热点。mts含量的检测,对于制定管理措施和监测环境污染情况具有重要的现实意义。

到目前为止,关于mts的测定方法主要有金属饱和法、电化学法、分光光度法、免疫法和色谱法等。但这些方法大都存在缺乏足够的选择性和灵敏度的不足,且由于需要昂贵的复杂设备和涉及繁琐的程序,导致这些方法难以普及。因此,建立一种快速、灵敏、便捷的mts检测方法具有十分重大的意义。

近年来,荧光光谱技术(fl)由于操作简单、灵敏度高和稳定性强,在各类文献中被大量报道。而碳量子点(cqds/cds)作为一种新的碳纳米材料,在水溶性、化学稳定性、光稳定性、低细胞毒性和良好的生物相容性等方面具有明显的优势,因此在化学和生物分析中得到了广泛的关注。



技术实现要素:

本发明的目的是提供一种基于碳量子点-金纳米粒子体系的金属硫蛋白检测方法,以实现对金属硫蛋白简便、快速、灵敏的检测。

本发明所述的基于碳量子点-金纳米粒子体系的金属硫蛋白检测方法包括以下步骤。

1)、以l-谷氨酸和4-氨基水杨酸为原料,溶于水中进行水热反应,制备得到发射光谱为521~525nm的绿色荧光碳量子点。

2)、配制等体积含相同浓度碳量子点且含不同浓度金纳米粒子的一系列碳量子点-金纳米粒子溶液,分别检测其荧光强度,取荧光强度最低的溶液作为碳量子点-金纳米粒子标准溶液,将其荧光强度记为f0。

3)、配制等体积含相同浓度碳量子点-金纳米粒子标准溶液且含不同浓度金属硫蛋白的一系列金属硫蛋白标准溶液,分别检测其荧光强度f

4)、建立(ff0)/f0与金属硫蛋白浓度cmts之间的线性关系式。

5)、以待测样品配制与金属硫蛋白标准溶液等体积的含相同浓度碳量子点-金纳米粒子标准溶液的待测样品溶液,检测其荧光强度,代入4)中得到的线性关系式中,计算出待测样品溶液中的金属硫蛋白浓度。

本发明上述建立的金属硫蛋白检测方法中,所述碳量子点制备中的原料l-谷氨酸与4-氨基水杨酸质量比为1∶1.5~2.5。

进一步地,所述水热反应优选在80~200℃下反应5~12h。

更具体地,本发明是以l-谷氨酸和4-氨基水杨酸为原料,溶于水中进行水热反应,得到橙色的碳量子点原溶液,对所得碳量子点原溶液过滤、离心得到碳量子点溶液,用透析袋透析,经冷冻干燥得到黑色的碳量子点固体。

进而,本发明中,对所述碳量子点原溶液过滤、离心以得到碳量子点溶液具体是用孔径0.1~0.5μm的滤膜将所述碳量子点原溶液过滤1~6次,将过滤后的碳量子点原溶液离心分离10~30min,取上清液得到碳量子点溶液。对所述碳量子点溶液的透析处理具体是使用500~2000da的透析袋将碳量子点溶液透析5~24h。

本发明上述制备的碳量子点平均粒径1~5nm,在390nm激发波长下,于522nm处具有最大发射峰,在365nm紫外灯照射下呈现绿色荧光。

具体地,本发明所述碳量子点-金纳米粒子溶液的具体配制过程是:分别量取一系列不同体积的金纳米粒子原溶液,加入相同体积的相同浓度碳量子点溶液,以超纯水稀释至相同体积,配制成一系列含相同浓度碳量子点不同浓度金纳米粒子的碳量子点-金纳米粒子溶液。

其中,所述碳量子点-金纳米粒子溶液中的碳量子点浓度为0.02mg/ml。

本发明所述金纳米粒子原溶液使用的金纳米粒子的直径为13nm,spr峰在520nm或521nm处。优选地,本发明所述的金纳米粒子购自河南纳晶科技有限公司。

进而,本发明所述金属硫蛋白标准溶液的具体配制过程是:以金属硫蛋白冻干粉和超纯灭菌水配制金属硫蛋白原溶液,分别量取一系列不同体积的金属硫蛋白原溶液,加入相同体积的碳量子点-金纳米粒子标准溶液,以柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液稀释至相同体积,配制成一系列含相同浓度碳量子点-金纳米粒子标准溶液不同浓度金属硫蛋白的金属硫蛋白标准溶液。

其中,所述的金属硫蛋白原溶液是在每1ml超纯灭菌水中加入0.01g分子量为6500的金属硫蛋白冻干粉,混合均匀配制得到。

更具体地,所述柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液的ph值约为3.0,浓度为0.01~1mol/l。

本发明上述建立的基于碳量子点-金纳米粒子体系的金属硫蛋白检测方法可以适用于任何水溶液体系中金属硫蛋白的检测。

进而,本发明上述建立的金属硫蛋白检测方法可以用于尿液中金属硫蛋白浓度的检测。

本发明建立的检测方法基于荧光共振能量转移(fret)机制,利用了金纳米粒子不仅有效猝灭碳量子点荧光,而且与碳量子点结合为荧光纳米复合物的性质,制成了一种新的荧光传感器,从而实现了对金属硫蛋白浓度的检测。

本发明利用碳量子点-金纳米粒子体系检测金属硫蛋白浓度,检测结果准确可靠,实现了对金属硫蛋白的简便、快速、灵敏检测,并成功应用于尿液中金属硫蛋白的检测。

本发明检测方法采用的碳量子点具有很好的光稳定性和水溶性,激发光谱较宽,方便检测,尤其适用于390nm处的激发光,得到的荧光光谱效果较好。

附图说明

图1是系列碳量子点-金纳米粒子溶液的荧光光谱图。

图2是系列金属硫蛋白标准溶液的荧光光谱图。

图3是金属硫蛋白标准溶液荧光强度与金属硫蛋白浓度间的线性关系曲线。

图4是共存组分对含有金属硫蛋白的碳量子点-金纳米粒子体系荧光强度的影响。

具体实施方式

以下结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明,以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。下述实施例仅为本发明的优选技术方案,并不用于对本发明进行任何限制。对于本领域技术人员而言,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。

需要说明的是,下述实施方式中所述的实验方法,如无特殊说明均为常规方法,所述试剂和材料,如无特殊说明,均可从商业途径获得。

实施例1。

分别称取0.5gl-谷氨酸和1.04g4-氨基水杨酸,加入到20ml去离子水,搅拌溶解得到混合溶液。

将混合溶液转移至50ml带聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压反应釜中,升温至200℃加热反应7h。反应完成后,自然冷却至室温,得到碳量子点原溶液。

将碳量子点原溶液以10000r/min离心15min,取上清液,以0.22µm微孔过滤器进行过滤,得到澄清的橙色溶液,置于透析膜(mwco=1kda)中,于去离子水中透析24h。

对透析后的碳量子点溶液进行冷冻干燥,制备得到黑色的掺氮碳量子点固体粉末。

经测定,所制备碳量子点的水溶液的最佳激发波长为390nm。在该激发波长下,碳量子点水溶液的最佳发射波长位于522nm处。

实施例2。

取实施例1制备的碳量子点固体粉末,分散在去离子水中,配制成浓度为2.0mg/ml的碳量子点溶液。

分别量取0µl、12.5µl、25µl、37.5µl、50µl、62.5µl、75µl、87.5µl、100µl、112.5µl、125µl、137.5µl、150µl浓度为6.96nm的金纳米粒子溶液,加入5µl浓度为2.0mg/ml的碳量子点溶液,室温下反应5min,以超纯水稀释至500µl,配制成金纳米粒子浓度分别为0、0.174、0.348、0.522、0.696、0.87、1.044、1.218、1.392、1.566、1.74、1.914和2.088nm的系列碳量子点-金纳米粒子标准溶液。

采用荧光分光光度计,在390nm的激发波长下分别检测上述系列碳量子点-金纳米粒子标准溶液的荧光强度。检测结果如图1,其中金纳米粒子浓度为2.088nm时,标准溶液的荧光强度最低,即碳量子点与金纳米粒子之间的猝灭效率最高。

实施例3。

称取少量金属硫蛋白冻干粉,溶解在10ml灭菌水中,配制成金属硫蛋白原溶液,采用ellman's试剂定量法,以标准曲线测定出其浓度为1.17×10-6mol/l。

分别量取5μl浓度2.0mg/ml的碳量子点溶液和150μl浓度6.96nm的金纳米粒子溶液于不同微量离心管中,室温下反应5min。再分别加入0µl、5µl、10µl、20µl、30µl、40µl、50µl、60µl、70µl、80µl、90µl金属硫蛋白原溶液,并各加入浓度0.01mol/l的柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液(ph=3.0)30μl,以去离子水定容至500μl,其中金属硫蛋白浓度(cmts)分别为0、1.2、2.3、4.7、7.0、9.4、12、14、16、19、21×10-8mol/l,50℃加热30min使其反应充分,得到系列金属硫蛋白标准溶液。

实施例4。

采用荧光分光光度计,在390nm激发波长下分别检测实施例3制备的系列金属硫蛋白标准溶液的荧光强度f,检测结果如图2。将金属硫蛋白浓度为0mol/l的标准溶液的荧光强度记为f0。

以(ff0)/f0值为纵坐标,金属硫蛋白浓度(cmts)为横坐标,根据stern-volmer方程可以计算出(ff0)/f0与金属硫蛋白浓度之间的线性关系式,具体如图3。

线性方程:(ff0)/f0=0.00432cmts(nmol/l)﹣0.0144,相关系数r2=0.9951。

根据图3可以看出,碳量子点-金纳米粒子体系的荧光恢复效率与金属硫蛋白浓度在12~210nmol/l的较宽范围内成正比。进而,根据检出限计算方法,计算出其金属硫蛋白的检出限可以达到5.25×10-9mol/l。

因此,本发明建立的金属硫蛋白荧光光谱检测方法具有高的检测灵敏度,可以用于检测人、植物或其他生物样品中的微量金属硫蛋白含量,并显示出诸如检测成本低、易于操作和无细胞毒性等许多优点。

实施例5。

取一定体积的待测尿液样品,加入等体积的0.01mol/ltris-hcl缓冲液(ph=8.6)混合均匀,4℃,4000r/min转速下离心20min。取上清液,80℃下加热10min,冷却至室温,相同条件下再次离心,取上清液,与无水乙醇以体积比1∶3混合后,于冰箱中-20℃下过夜。

将过夜样品以相同条件离心30min,取沉淀物,溶于一定体积的0.01mol/ltris-hcl缓冲液(ph=8.6)中,相同条件离心20min。将残留物除去乙醇,溶解在一定体积的去离子水中,相同条件离心30min,取上清液,得到预处理尿液样品。

量取5μl浓度2.0mg/ml的碳量子点溶液和150μl浓度6.96nm的金纳米粒子溶液于微量离心管中,室温下反应5min。再加入200μl预处理尿液样品,加入浓度0.01mol/l的柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液(ph=3.0)30μl,以去离子水定容至500μl,50℃加热30min使其反应充分,制备得到待测样品溶液。

采用荧光分光光度计,在390nm激发波长下检测待测样品溶液的荧光强度f,代入实施例4得到的线性方程中,计算出待测样品溶液中的金属硫蛋白浓度。

实施例6。

分别采用本发明建立的荧光光谱检测方法,和常规的紫外-可见吸收光谱法,针对正常人、肺肿瘤患者、肝肿瘤患者尿液中的金属硫蛋白进行检测,验证所建立金属硫蛋白荧光光谱检测方法在实际样品分析中的准确性和检测灵敏性。

按照实施例5方法检测出各自尿液中的金属硫蛋白原始浓度。

在实施例5的预处理尿液样品中加入已知量的金属硫蛋白溶液,按照实施例5中方法制备待测样品溶液,检测其金属硫蛋白浓度,结合金属硫蛋白原始浓度,计算出加入金属硫蛋白的回收率。

常规的紫外-可见吸收光谱法基于viarengo等改进的ellman试剂定量法:在ph=8.0的tris-hcl缓冲溶液中,5,5'-二硫代双-(2-硝基苯甲酸)与金属硫蛋白中的巯基反应生成黄色的tnb。tnb在412nm处具有最大吸收,测量412nm波长处吸光度值(a),根据标准曲线计算出相应的-sh浓度。同样在样品中加入已知量的金属硫蛋白,检测并计算出加入金属硫蛋白的回收率。

以上具体检测结果列于表1中。

从表1可以看出,两种方法的回收率之间没有显著性差异。

但是,采用本发明的荧光光谱检测方法可以检测出各种尿液样品中金属硫蛋白的原始浓度,而紫外-可见吸收光谱法则无法检出或检出值显著小于本发明方法。同时,紫外-可见吸收光谱法的回收率测定需要加入更多的金属硫蛋白才能进行。因此,与常规的紫外-可见吸收光谱法相比,本发明的荧光光谱检测方法具有检出限低、灵敏度高、回收率高的优点。

实施例7。

本实施例考察待测样品溶液中同时存在的其他共存组分对碳量子点-金纳米粒子体系荧光强度的影响。

待测样品溶液中,金纳米粒子浓度2.09nmol/l,金属硫蛋白浓度2.1×10-7mol/l。在待测样品溶液中分别加入浓度为1.0μm的半胱氨酸、谷胱甘肽,以及浓度为1.0×10-4mol/l的pb2+,mg2+,no3-,cl-,cu2+,fe2+,na+,k+,fe3+,zn2+,so42-,cd2+,组氨酸,甘氨酸和葡萄糖。按照实施例5方法检测待测样品溶液的荧光强度,与未加入共存组分待测样品溶液的荧光强度进行比较。

从图4可以看出,除部分金属阳离子、半胱氨酸和谷胱甘肽外,未观察到其他共存组分加入后荧光强度的明显变化,表示其对金属硫蛋白的测定基本没有影响。

一些金属阳离子如pb2+、fe2+、cu2+、cd2+等,即便其加入浓度高出金属硫蛋白数百倍,对于系统荧光恢复的影响也非常小,因此,其对于金属硫蛋白测定的影响也完全可以忽略。

半胱氨酸和谷胱甘肽会导致系统荧光强度的增强,原因是半胱氨酸和谷胱甘肽的巯基也可能与金纳米粒子相互作用释放碳点,从而恢复系统的荧光强度。但由于实际样品检测时会进行样品预处理,在预处理过程中可以消除半胱氨酸的干扰。此外,金属硫蛋白的巯基含量远高于谷胱甘肽,所以对金纳米粒子具有更强的亲和力。

因此,当在低浓度范围内检测金属硫蛋白时,半胱氨酸和谷胱甘肽对检测的干扰微不足道。本发明建立方法对于金属硫蛋白的检测具有良好的选择性。


技术特征:

1.一种基于碳量子点-金纳米粒子体系的金属硫蛋白检测方法,所述方法包括:

1)、以l-谷氨酸和4-氨基水杨酸为原料,溶于水中进行水热反应,制备得到发射光谱为521~525nm的绿色荧光碳量子点;

2)、配制等体积含相同浓度碳量子点且含不同浓度金纳米粒子的一系列碳量子点-金纳米粒子溶液,分别检测其荧光强度,取荧光强度最低的溶液作为碳量子点-金纳米粒子标准溶液,将其荧光强度记为f0;

3)、配制等体积含相同浓度碳量子点-金纳米粒子标准溶液且含不同浓度金属硫蛋白的一系列金属硫蛋白标准溶液,分别检测其荧光强度f

4)、建立(ff0)/f0与金属硫蛋白浓度cmts之间的线性关系式;

5)、以待测样品配制与金属硫蛋白标准溶液等体积的含相同浓度碳量子点-金纳米粒子标准溶液的待测样品溶液,检测其荧光强度,代入4)中得到的线性关系式中,计算出待测样品溶液中的金属硫蛋白浓度。

2.根据权利要求1所述的金属硫蛋白检测方法,其特征是所述用于制备碳量子点的l-谷氨酸与4-氨基水杨酸质量比为1∶1.5~2.5。

3.根据权利要求1所述的金属硫蛋白检测方法,其特征是所述的水热反应是在80~200℃下反应5~12h。

4.根据权利要求1所述的金属硫蛋白检测方法,其特征是将水热反应得到的碳量子点原溶液过滤、离心,透析、冷冻干燥,以得到所述碳量子点。

5.根据权利要求4所述的金属硫蛋白检测方法,其特征是采用孔径0.1~0.5μm的滤膜过滤所述碳量子点原溶液,所述透析是使用500~2000da的透析袋透析5~24h。

6.根据权利要求1所述的金属硫蛋白检测方法,其特征是所述的碳量子点-金纳米粒子溶液是分别量取一系列不同体积的金纳米粒子原溶液,加入相同体积的相同浓度碳量子点溶液,以超纯水稀释至相同体积配制而成。

7.根据权利要求6所述的金属硫蛋白检测方法,其特征是所述碳量子点-金纳米粒子溶液中的碳量子点浓度为0.02mg/ml。

8.根据权利要求1所述的金属硫蛋白检测方法,其特征是所述的金属硫蛋白标准溶液是以金属硫蛋白冻干粉和超纯灭菌水配制金属硫蛋白原溶液,分别量取一系列不同体积的金属硫蛋白原溶液,加入相同体积的碳量子点-金纳米粒子标准溶液,以柠檬酸钠-盐酸缓冲溶液稀释至相同体积配制而成。

9.权利要求1所述的金属硫蛋白检测方法在检测各种水溶液体系中金属硫蛋白上的应用。

10.权利要求1所述的金属硫蛋白检测方法在尿液中金属硫蛋白浓度检测中的应用。

技术总结
本发明公开了一种基于碳量子点‑金纳米粒子体系的金属硫蛋白检测方法,是以L‑谷氨酸和4‑氨基水杨酸进行水热反应制备绿色荧光碳量子点,分别检测碳量子点‑金纳米粒子标准溶液的荧光强度F0和系列金属硫蛋白标准溶液的荧光强度F,建立(F﹣F0)/F0与金属硫蛋白浓度cMTs间的线性关系式,检测待测样品溶液的荧光强度,代入线性关系式中计算出其金属硫蛋白浓度。本发明方法可以简便、快速、灵敏的检测金属硫蛋白,适用于任何水溶液体系特别是尿液中金属硫蛋白的检测。

技术研发人员:段炼;孙玥;赵慧君;杜晓宇
受保护的技术使用者:太原理工大学
技术研发日:2020.05.25
技术公布日:2020.08.21

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