分享核酸纯化方法

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专利名称:核酸纯化方法
核酸纯化方法本发明涉及利用核酸结合支持材料纯化核酸的方法和试剂盒。此外,描述了纯化适当支持材料的合适方法。现有技术中已公开了各种纯化和分离核酸的方法,包括使用苯酚氯仿、盐析法,使用离子交换剂和二氧化硅颗粒。已知的核酸纯化方法是“电荷转换法”。该方法包括使主要含有弱碱性聚合物例如多聚Bis-Tris、多聚Tris、聚组胺、多羟基化胺、壳聚糖或三乙醇胺的核酸结合相在第一 pH 下与含核酸样品接触,在此期间核酸结合相带正电荷。这有利于带负电荷的核酸与所述相结合。要释放/洗脱核酸,根据电荷转换原理,设定高于所述核酸结合相的PKa的第二 pH, 以逆转或中和正电荷。将PH设定为高于固相的核酸结合基团的pKa,促使结合的核酸从核酸结合相解离。现有技术公开了可溶相(见,例如,EP 0 707 077)和固相(见,例如,WO 99/29703)。各种溶液用以洗脱,例如具有很高pH的溶液或其它生物缓冲液,特别是低盐缓冲液诸如Tris缓冲液。纯化的核酸通常作进一步处理。所述进一步处理包括,例如,扩增如聚合酶链式反应(PCR),酶反应如限制性(酶切)、连接、磷酸化、去磷酸化或RNA转录,杂交体捕捉试验和电泳。这些“下游”反应对较高盐浓度的耐受性常较低,因此,在处理核酸前必须频繁进行脱盐步骤。因此,对于纯化核酸的后续立即应用而没有附加的缓冲液更换或脱盐步骤,不含太多盐并且碱性不太高的洗脱缓冲液是理想的。然而,阴离子交换剂的洗脱性能随着洗脱缓冲液中PH和盐浓度的增加而增加。因此,色谱要求与DNA处理的要求直接矛盾。所以,本领域试图通过选择合适的核酸结合基团和PH条件来特异性促进核酸洗脱。虽然有已知的方法纯化核酸,但仍需要改进现有方法,具体地说,如此特异性纯化核酸,即,样品随后还可作立即处理。因此,本发明的目的是提供纯化核酸的方法,该方法能随后立即处理样品。更具体地说,本发明打算提供能在低盐浓度下洗脱的方法。按照本发明,通过利用特定核酸结合相的纯化核酸方法实现该目的。 按照第一实施方式,所述核酸结合相具有pKa为8-13的核酸结合基团A,还具有减弱结合并在所用结合PH下具有中性电荷的基团N。利用该核酸结合相的纯化方法具有以下步骤(a)在低于核酸结合基团A的pK的pH下(结合pH)结合核酸与核酸结合相;(b)在高于结合pH的pH下(洗脱pH)洗脱核酸。本发明涉及借助核酸结合相纯化核酸,除核酸结合基团A以外,所述核酸结合相还具有结合减弱基团N。按照本发明,核酸结合基团A的pKa为8-13。核酸在低于至少一个所述基团A的pKa的pH下结合。因此,基团A获得质子,结果变成带正电荷,从而核酸结合相能结合带负电荷的核酸。在高于结合PH的pH下进行洗脱,从而减少核酸结合相的正电荷。附加基团N在结合pH、还优选在洗脱pH下是电中性的。因此,基团N在以下几方面影响基团A的结合强度(1)它们干扰基团A的排列,由于A基团密度降低,因此影响核酸与核酸结合相的结合强度。(2)借助能进行弱相互作用(例如通过范德华相互作用)到中等强度相互作用(例如通过氢键)的官能团,它们能特异性调节结合强度。(3)随着尺寸和/或数量增加,基团N能空间屏蔽核酸结合基团A,从而降低结合强度。因此,基团N导致核酸结合强度发生均勻的、不依赖PH的降低。结果,结合的核酸较少,随后更易从核酸结合相解离。基团N的功能是以特异性和受控方式降低结合强度和/或基团A数量,从而设定本发明核酸结合相的所需频率。基团N的比例越高,基团A的比例越低,电荷密度越低,核酸与核酸结合相的结合越弱。可借助制备方法特异性调节基团A与基团N之比,以在制备相应核酸结合相的方法(例如,通过聚合、(聚)缩合,特别是通过支持材料的涂层)中或者通过所述方法事先设定所需核酸结合强度。该方法的主要优点在于能在洗脱核酸纯化后立即作进一步处理的条件下进行洗脱。多种生物技术方法,例如扩增核酸(特别是借助PCR)、测序、逆转录、限制性分析和其它方法(参见上文)对于洗出液中的污染,特别是高盐浓度敏感。本发明的纯化方法能有利地在低盐浓度或低离子强度下洗脱,从而能在后续生物技术方法,特别是PCR反应中立即作进一步处理。利用基团N减弱核酸的结合产生出乎意料的好结果。为方法优化,现有技术采取核酸的最佳结合,然后致力于优化结合,特别是洗脱条件。相比之下,认为减弱结合强度不利于预期产率,例如,因为核酸在结合步骤中仅与核酸结合相不充分地结合或者可在洗涤期间洗脱。鉴于此,本发明的概念,即,成功和温和纯化核酸,但结合强度因存在基团N而降低,必须视作极其出乎意料。依据N基团,A基团的比例可以从1 %到99%、1到50%、优选1 %到25%。按照优选的实施方式中,修饰核酸结合相以引入基团A和N。按照本发明,其包括各种实施方式,下文将详细说明。按照一个实施方式,给核酸结合相提供不同配体(配体I和配体II),其中配体I 具有至少一个基团A,配体II具有至少一个基团N。该实施方式示于

图1A。随后,基团A和 N接近,还可形成聚合物涂层。由于存在携带N-基团的配体II,A基团的数量减少,从而降低核酸的结合紧密度,特别是在利用支持材料的情况下。因此,基团N导致支持物表面上的基团A密度降低,所以核酸的结合亲和力降低。结果,核酸更易于洗脱。术语“配体”尤其指表面的官能化,优选用至少一个基团A和/或一个基团N修饰支持材料以提供本发明的核酸结合相。配体I和II优选结合于支持材料,可以是,例如单个反应分子的单体、二聚体、 寡聚体或多聚体。在一个变化形式中,基团A或基团N作为与支持材料反应的化合物的一部分直接结合于或通过连接体(Iikner)或间隔体(spacer)结合于支持材料。按照优选的实施方式,通过支持材料接触具有不同配体I和II的混合物实现该修饰。配体II相对于配体I的比例越高,与核酸的结合强度越低。可简单地通过涂布过程中配体I和配体II反应物的相应比例来控制该比例。细节以及相应支持材料的合成或制备方法如下所示。配体还可形成聚合物涂层。还可给支持材料提供基团A和起始分子T,所述起始分子结合有一个或多个基团N。该实施方式描述于图1B)。此例中,基团N相对于支持材料的表面位于基团A之上。还可能通过起始分子连接基团A。按照本发明的进一步实施方式,用核酸结合配体修饰支持材料,其中一个或多个基团A和一个或多个基团N存在于单个配体内。该实施方式详细描述于图2。有各种可能性实现该想法。按照一个变化形式,给支持材料提供携带一个或多个含有基团N的化合物的基团 A (直接结合或经例如起始分子T结合)(也参见图2A)。如果存在多个基团N,它们还可以是非支链的形式或有支链的树状结构或相应的混合物。其可包括,例如每个配体1-100个基团N,1-20、优选1-10、特别优选1-5个基团N。如果需要,还可引入更多基团A和N。该连接策略产生实际上纯粹为A-基团占据的较均勻的结合平面和外部毗连并因N基团占据而降低基团A的结合强度的一个或多个平面。按照该实施方式的进一步变化形式,给支持材料提供基团A (直接结合或经例如起始分子T结合),其携带N基团和A基团的混合物(也参见图2B)。这可包括将第一批一个或多个基团A结合于支持材料。然后将配体化合物连接于这些含A的主干(trunk),从而引入至少一个或多个基团N。控制反应条件能在各情况中使得配体中仅存在基团A和N ;然而,配体还可以是寡聚物或聚合物的形式。设计成寡聚物和聚合物的配体可具有随机分布的基团N(参见,例如图2B,右图)、其交替序列(参见,例如图2B,左图)或其排列成嵌段共聚物。还可能有组合。下文描述了设计含A和N的适当官能/配体的合适方法。按照进一步的实施方式,用基团A和N修饰支持材料,其中基团A被具有至少一个、优选多个基团N的化合物空间屏蔽。该实施方式也有各种变化形式。按照一个变化形式,优选通过具有基团N的寡聚物或聚合物进行空间屏蔽。所述寡聚物或聚合物可结合于,例如具有一个或多个基团A的配体(也参见图3B)。然而,还可将它们毗邻排列,只要能确保空间屏蔽即可(也参见图3A)。具有N基团的寡聚物/聚合物通过形成或多或少的有序二级结构(例如,“随机线圈”或螺旋),经由来自环境的一类帽 (cap)来屏蔽基团A,因此能减弱核酸结合。还可从基团N制备寡聚物/聚合物,还可借助嵌段共聚物引入。可通过,例如在第一步骤中将起始基团T应用于支持材料(例如通过硅烷化)来制备该变化形式。在第二步骤中,随后通过例如ATRP (原子转移自由基聚合)对含有基团A 的单体进行接枝。该单体完全反应后,可引入具有中性基团N的第二单体。这样在支持物上产生共聚物,其由携带阴离子交换基团的第一均聚物和连接于第一均聚物并携带中性基团N的第二均聚物组成。可通过携带基团N的第二单体的用量控制新生聚合物链的长度以及由此产生的空间屏蔽强度。因此,可通过链长度和单体取代控制空间屏蔽程度。具有N基团的寡聚物/聚合物的优选链长度是η = 10-1000, η = 10-500,特别优选η = 10-100。可利用将要详述的本申请描述的单体设计携带基团N的寡聚物/聚合物。聚丙烯酸酯尤其适合。所用的优选聚合物是下式所示聚丙烯酸酯
权利要求
1.利用核酸结合相,通过结合和洗脱来纯化核酸的方法,其特征在于,所述核酸结合相具有(i)pKa为8-13的核酸结合基团A ;( )在所用结合PH下具有中性电荷的电中性基团N;和所述方法至少具有以下步骤(a)在低于核酸结合基团A的pK的ρΗ下(结合ρΗ)结合核酸与核酸结合相;(b)在高于所述结合ρΗ的ρΗ下(洗脱ρΗ)洗脱核酸。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述核酸结合相是修饰的支持材料,所述修饰选自下组;(i)用至少具有配体I和II的混合物修饰所述支持材料,其中所述配体I具有至少一个基团A,所述配体II具有至少一个基团N ;( )用核酸结合配体修饰所述支持材料,所述配体在其中各自具有一个或多个基团A 和一个或多个基团N ;(iii)用基团A和N修饰所述支持材料,其中基团A被具有至少一个基团N的化合物空间屏蔽;(iv)通过实施方式(i)到(iii)中至少两个的组合修饰所述支持材料。
3.利用核酸结合支持材料,通过结合和洗脱来纯化核酸的方法,其特征在于,用核酸结合基团A修饰所述支持材料,其中所述支持材料仅有一部分被基团A占据。
4.如权利要求3所述的方法,其特征在于,所述支持材料具有一种或多种以下特征 (i)所述支持材料具有含基团A的硅烷涂布的二氧化硅表面,硅烷量是0. 1到50口11101,优选0. 1 到 10 μ mo 1 ;和 / 或( )其还具有如权利要求1所述的基团N ;和/或 (iii)其具有如权利要求2限定的一种或多种修饰。
5.如权利要求1-4中一个或多个所述的方法,其特征在于,所述核酸结合相具有符合一种或多种以下特征的支持材料(i)所述支持材料是氧化性材料;和/或( )所述支持材料选自A1203、TiO2, ZrO2, Ta2O5, SiO2和聚硅酸;和/或(iii)所述支持材料是SW2或聚硅酸;和/或(iv)所述支持材料是有机聚合物,特别是选自聚苯乙烯及其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物; 和/或(ν)所述支持材料是多糖,特别是水凝胶,例如琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖、聚丙烯酰胺葡聚糖或壳聚糖;和/或(vi)所述支持材料是玻璃或金属;和/或(vii)所述支持材料是磁性的。
6.如权利要求1-5中一个或多个所述的方法,其特征在于,所述核酸结合相具有符合一种或多种以下特征的基团A ⑴基团A具有9到13,优选10到12,特别优选10-11的pK ;和/或 ( )所述基团A是叔氨基、仲氨基或伯氨基基团;和/或
7.如权利要求1-6中一个或多个所述的方法,其特征在于,结合步骤(a)和/或洗脱步骤(b)在符合一种或多种以下特征的条件下进行⑴在洗脱步骤(b)中,洗脱PH低于基团A的pK ;和/或(ii)结合和/或洗脱缓冲液中的盐浓度为ImM到IOOOmMUmM到500mM、lmM到250mM 或ImM到IOOmM ;和/或(iii)结合步骤(a)和/或洗脱步骤(b)中盐浓度未变或在洗脱期间升高;和/或(iv)所述结合缓冲液中的pH为pH2到pH 8、pH 2到pH 7. 5、pH 4到pH 8或pH 4 IlJpH 7. 5,和 / 或(ν)所述洗脱缓冲液中的pH为pH 2到pH 10、pH 4到pH 10、pH 7到pH 10或pH 8 到pH 9 ;和/或(vi)结合步骤(a)和/或洗脱步骤(b)中温度未变或在洗脱期间升高;和/或(vii)所述洗脱步骤中的温度是2°C到95°C或21°C到60°C。
8.如权利要求1-7中一个或多个所述的方法,其特征在于,所述基团N符合一种或多种以下特征(i)所述基团N选自羟基、二醇基团、三醇基团、多元醇基团、糖类、环氧化物基团、卤化物、烷基、优选C1-C6烷基、烯基、炔基、酰亚胺基团、醚基团或聚醚基团,和/或到C3烷基;和(iii)所述基团A是可聚合单体的诸部分;和/或(iv)所述基团A结合于经由反应活性硅烷事先施加的起始分子;和 (ν)所述基团A作为反应活性硅烷基团的一部分引入;和/或(vi)所述基团A作为选自下组的化合物的一部分引入或
9.如权利要求1-8中一个或多个所述的方法,其特征在于,符合一种或多种以下特征(i)通过硅烷化给所述支持材料提供基团A和N;和/或(ii)通过反应活性硅烷引入基团A和/或N和/或T;和/或(iii)通过单官能、双官能或三官能反应活性硅烷或至少两种不同官能的反应活性硅烧的混合物引入基团A和/或N ;和/或(iv)通过选自下组的反应活性硅烷引入基团A和/或N氨基硅烷、二硅氮烷、氯硅烧或烷氧基硅烷;和/或(ν)基团A对基团N的比例是1 %到99%、1到50%、优选1 %到25%。
10.如权利要求2-9中一个或多个所述的方法,其特征在于,具有一种或多种以下特征(i)用起始分子T修饰所述支持材料,其中随后引入单体形式的所述基团A和/或基团 N ;和/或( )用起始分子T修饰所述支持材料,其中所述起始分子具有一种或多种以下特征 (aa)所述起始分子是反应活性硅烷;和/或 ( )所述基团N在2 <pH< 12的pH范围内是电中性的;和/或(iii)所述基团N在所用的洗脱pH下携带中性电荷;和/或(iv)所述基团N作为可聚合单体的一部分引入;和/或(ν)所述基团N结合于经由反应活性硅烷事先施加的起始分子;和/或(vi)所述基团N作为反应活性硅烷基团的一部分引入;和/或(vii)所述基团N作为选自下组的化合物的一部分引入(bb)所述起始分子选自下组
11.如权利要求1-10中一个或多个所述的方法,其特征在于,所述支持材料具有起始基团T,该基团用具有基团A的化合物至少部分官能化,所述基团A被基团N空间屏蔽,所述空间屏蔽是通过一种或多种以下修饰产生的(i)所述基团N是空间屏蔽基团A的支链或非支链寡聚物或聚合物的形式;和/或 ( )所述基团N是由单体组成的寡聚物或聚合物的形式,其链长度是η = 10-1000,优选 η = 10-100 ;和 / 或(iii)所述基团N经由聚丙烯酸酯提供,优选下式所示
12.制备如权利要求1-6和8-11中一个或多个限定的核酸结合支持材料的方法,按照以下备选方案(A)到(F)中至少一个实施所述方法备选方案(A)利用至少两种配体I和II的混合物对所述支持材料进行官能化,其中配体I具有至少一个基团A,配体II具有至少一个基团N ;和/或备选方案(B) :(a)用起始分子T和具有至少一个基团A的配体的混合物对所述支持材料进行官能化,和(b)加入具有至少一个基团N的化合物并结合所述化合物与所述起始分
13.如权利要求12所述的方法,其特征在于,其符合至少一种以下特征 (i)所述基团A是叔氨基、仲氨基或伯氨基基团;和/或( )所述基团N选自羟基、二醇基团、三醇基团、多元醇基团、糖类、环氧化物基团、商化物、C1-C6烷基、烯基、炔基、酰亚胺基团、醚基团或聚醚基团,和/或(iii)所述基团N在洗脱pH,优选在2<pH< 12的指定pH范围内是电中性的;和/或(iv)所述基团A禾Π/或N通过单体引入;和/或 (ν)所述基团A和/或N通过硅烷化引入;和/或(vi)所述基团A和/或N通过反应活性硅烷引入;和/或(vii)利用单官能或双官能和/或三官能反应活性硅烷引入所述基团A和/或N;和/或(viii)利用选自下组的反应活性硅烷引入基团A和/或N氨基硅烷、二硅氮烷、氯娃烧或烷氧基硅烷;和/或(ix)通过选自下组的反应活性硅烷引入基团A和/或N丙二醇、丙三醇、丁三醇、3-缩水甘油氧基丙基、乙基缩水甘油基醚、烷基,特别是Cl到C4烷基,特别是甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基,卤化物或氢;(χ)基团A对基团N的引入比例使得A基团的比例是1 %到99%、1到50%、优选1 % 到25% ;和/或(xi)用具有一种或多种以下特征的起始分子T修饰所述支持材料 (aa)通过硅烷化施加所述起始分子;和/或 (bb)所述起始分子是硅烷;和/或 (cc)所述起始分子选自
14.权利要求1-6和8-11中一个或多个限定的或可按照权利要求12和13中任一个得到的核酸结合支持材料在纯化核酸中的应用。
15.纯化核酸的试剂盒,其特征在于,其具有如权利要求1-6和8-11中一个或多个限定的支持材料或可按照权利要求12或13得到的支持材料。
全文摘要
本发明涉及利用核酸结合相纯化核酸的方法,所述核酸结合相的pKa为8-13的核酸结合基团A不足,或具有基团A和在结合期间、优选在洗脱期间中性荷电的结合抑制性基团N;所述方法包括以下步骤(a)在低于核酸结合基团A的pK的pH下(结合pH)结合核酸与核酸结合相;(b)在高于所述结合pH的pH下(洗脱pH)洗脱核酸。此外,还公开了可用于纯化核酸的相应试剂盒及核酸结合相。本发明的技术能采用低盐浓度纯化核酸,特别是洗脱,因而可直接处理纯化的核酸,例如用于PCR。
文档编号C12N15/10GK102264902SQ200980152958
公开日2011年11月30日 申请日期2009年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者C·埃尔巴赫, R·法比斯 申请人:恰根有限公司

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