分享医用组织封闭胶组合物,医用组织封闭胶及其制备方法和应用

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医用组织封闭胶组合物,医用组织封闭胶及其制备方法和应用
本发明提供一种医用组织封闭胶组合物,医用组织封闭胶及其制备方法和应用,所述医用组织封闭胶组合物,包括:第一组分和第二组分,其中,第一组分包括:含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯基的第一修饰产物,所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个以上的活性基团,其中,所述活性基团为氨基、巯基;所述第二组分包括:在壳聚糖和/或聚赖氨酸上修饰有10个以上乙烯基的第二修饰产物。本发明的医用组织封闭胶具有较高的抗破裂强度和较低的溶胀率,并且具有良好的粘合性,可以使组织创面快速闭合,有效起到组织封闭的作用,防止组织液、血液或脑脊液泄漏,能够减轻病人的痛苦,并且避免了更多的危险性。

医用组织封闭胶组合物,医用组织封闭胶及其制备方法和 应用
技术领域
[0001] 本发明涉及一种医用组织封闭胶组合物,医用组织封闭胶及其制备方法和应用, 属于生物医药技术领域。

[0002] 医用组织封闭胶在医学上主要用在手术中或手术后对出血位点封闭止血、缺损组 织物理填充、防止组织脏器黏连、防止组织液渗漏等方面。医用组织封闭胶的主体材料按成 分可分为两类:一是人工合成类的水凝胶基材料,如聚乙二醇、丙烯酰胺类等;二是天然生 物材料,如明胶、胶原、壳聚糖、海藻酸钠、纤维素等。
[0003] 人工合成类的水凝胶材料分为可降解和不可降解两大类。其中,可降解的材料多 为聚乙二醇,聚乙烯亚胺等。现市售使用全合成可生物降解的材料得到的医用组织封闭胶 主要为COSEAUAngiotech医药品公司)和DURASEAL(Conf Iuent手术器械公司)的产品,此类 产品降解速度较快,但原材料成本较高,制备工艺较为复杂,直接导致整体的产品价格偏 尚。
[0004] 不可降解材料得到的医用组织封闭胶主要是丙烯酰胺类产品,其中氰基丙烯酸酯 类是不可降解产品的典型代表,如DERMABOND(Ethicon Surgical Care)。此类产品成胶后 具有较强的粘附力、成胶速度快等优点,但却存在着较多的组分残留、具有一定的生物毒 性、不可生物降解、除掉残留组分非常困难等问题,因此只能用于允许材料自然脱落或长时 间需要材料填充的环境。
[0005] 相对于人工合成类材料,天然生物材料也可以作为组织密封胶的主要材料。例如 GEFOAM的可吸收性明胶(Pharmacia&Upjohn,Kalamazoo,MI),强生(上海)医疗器材有限公 司的Bioseal和Surgif Io,以及纤维蛋白密封剂等;虽然天然生物材料具有成本低廉,来源 可靠,易于获取等优势,作为植入性医用材料已有长期的使用历史和安全评价,但其使用时 的功能效果和使用位置始终具有很高的局限性。



[0006] 发明要解决的问题
[0007] 本发明的目的是提供一种以天然物质为主体材料,制备可原位交联成型、具有较 高的涨破强度和粘附力、并具有较低溶胀率且可生物降解的医用组织封闭胶。
[0008] 用于解决问题的方案
[0009] 本发明提供一种医用组织封闭胶组合物,包括:第一组分和第二组分,其中,
[0010] 所述第一组分包括:含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有 巯基的第一修饰产物,所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个 以上的活性基团,其中,所述活性基团为氨基、巯基;
[0011]所述第二组分包括:在壳聚糖和/或聚赖氨酸上修饰有10个以上乙烯基的第二修 饰产物。
[0012]根据本发明的医用组织封闭胶组合物,其中,所述第一组分中的活性基团与所述 第二组分中的乙烯基的摩尔比为1:1~1:3,优选1:2~1:3。
[0013]根据本发明的医用组织封闭胶组合物,其中,所述第二修饰产物为修饰有乙烯基 的壳聚糖。
[0014] 根据本发明的医用组织封闭胶组合物,其中,所述含有氨基的天然物质为壳聚糖、 聚赖氨酸中的一种或两种。
[0015] 根据本发明的医用组织封闭胶组合物,其中,所述第一修饰产物是利用巯基化试 剂在所述含有氨基的天然物质上修饰巯基得到的;优选地,所述巯基化试剂为半胱氨酸、乙 酰基半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种或多种;更优选地,所述巯基化试剂为巯基乙 酸、巯基丙酸、乙酰基半胱氨酸中的一种或多种。
[0016] 根据本发明的医用组织封闭胶组合物,其中,所述含有氨基的天然物质、所述第一 修饰产物的重均分子量为3000~5000Da。
[0017] 本发明还提供一种医用组织封闭胶,其由本发明的医用组织封闭胶组合物的第一 组分和第二组分反应后形成;优选地,所述医用组织封闭胶由所述第一组分和所述第二组 分在缓冲溶液中反应后形成。
[0018] 根据本发明的医用组织封闭胶,其中,所述医用组织封闭胶由所述第一组分溶于 第一缓冲溶液中,所述第二组分溶于第二缓冲溶液中,然后混合、反应后形成。
[0019] 本发明还提供一种根据本发明的医用组织封闭胶的制备方法,包括以下步骤:
[0020] 将所述第一组分溶于第一缓冲溶液中,得到第一混合液;
[0021 ]将所述第二组分溶于第二缓冲溶液中,得到第二混合液;
[0022] 将所述第一混合液与第二混合液混合,得到所述医用组织封闭胶。
[0023] 根据本发明的医用组织封闭胶的制备方法,其中,所述第二修饰产物的制备方法 包括:
[0024] 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下,将所述壳聚糖和/或聚赖氨酸 接枝经活化的丙烯酸类化合物,得到所述第二修饰产物。
[0025] 根据本发明的医用组织封闭胶的制备方法,其中,所述第一修饰产物的制备方法 包括:
[0026] 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下,利用巯基化试剂在所述含有氨 基的天然物质上接枝巯基,得到所述第一修饰产物。
[0027]根据本发明的医用组织封闭胶的制备方法,其中,所述碳二亚胺类缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亚胺盐酸盐及其衍生物、N,N'_二异丙基碳二亚胺及其衍生物、 二环己基碳二亚胺及其衍生物中的一种或多种。
[0028] 根据本发明的医用组织封闭胶的制备方法,其中,所述酰化催化剂为4-二甲氨基 吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羟基苯并三唑及其衍生物、N-羟基琥珀酰亚 胺及其衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺及其衍生物中的一种或多种。
[0029] 本发明还提供一种医用组织封闭胶试剂盒,其包括本发明的医用组织封闭胶组合 物以及用于溶解所述医用组织封闭胶组合物的各组分的缓冲溶液。
[0030] 本发明还提供一种根据本发明的医用组织封闭胶在伤口粘合制品、内脏或软组织 伤口闭合制品、脑脊液及组织液封堵制品、大面积创伤止血辅助物、软组织修复补片与软组 织粘合制品中的应用。
[0031] 发明的效果
[0032] 本发明的组织密封胶具有较高的抗破裂强度和较低的溶胀率,并且具有良好的粘 合性,可以使组织创面快速闭合,有效起到组织封闭的作用,防止组织液、血液或脑脊液泄 漏,能够减轻病人的痛苦,并且避免了更多的危险性。
[0033] 本发明的医用组织封闭胶是采用具有生物相容性的天然物质制备得到的,在使用 时经过物理混合,可原位交联形成组织密封胶。具有良好的生物相容性,可以完全在人体内 进行降解代谢,并被排除体外无残留。并且本发明的医用组织封闭胶的制备方法简单,且易 于操作。

[0034] 图1为动物实验中的实验组Tl接受硬脑膜修补术后,将医用组织封闭胶II喷涂于 人工硬脑膜材料周围后的照片。
[0035] 图2为医用组织封闭胶II应用于自体硬脑膜修复部位的组织切片图。
[0036] 图3为细胞毒实验中,减去空白组之后的实验组和对照组的吸光度值(0D值)。

[0037] 本发明提供一种医用组织封闭胶组合物,医用组织封闭胶及其制备方法和应用, 本发明的医用组织封闭胶组合物主要包括含有亲核试剂的第一组分和含有亲电试剂的第 二组分,所述亲核试剂包括含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯 基的第一修饰产物,所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个以 上的活性基团,其中,所述活性基团为氨基、巯基;所述亲电试剂包括在壳聚糖和/或聚赖氨 酸上修饰有10个以上乙烯基的第二修饰产物。优选地,所述第一组分中,进行修饰巯基的位 置为主链和/或侧链上所含氨基(例如:伯氨基)的位置。
[0038] 本发明的含有氨基的天然物质和/或第一修饰产物以及第二修饰产物的主链和/ 或侧链上均具有多个可交联位点,从而使得含有氨基的天然物质和/或第一修饰产物与第 二修饰产物交联后具有较高的交联度,还具有突出的抗破裂强度和较低的溶胀率。
[0039] 本发明的医用组织封闭胶具有良好的粘合性,使组织创面快速闭合,有效起到组 织封闭的作用,能够防止组织液、血液或脑脊液泄漏,从而减轻病人的痛苦,避免了更多的 危险性。本发明的第一组分和第二组分能够在一定的物理共混的条件下通过迈克尔加成反 应机理形成一种交联的三维网状结构,从而起到组织封闭的作用。
[0040] 优选地,所述第一组分和第二组分可以是分离的,在使用时将第一组分和第二组 分混合。在实际应用的过程中,所述第一组分和第二组分可以分别单独储存,使用前或使用 时再溶解于同一溶剂中。为了使用方便,也可以将第一组分和/或第二组分分别在溶剂中以 预先溶解的形式储存,例如可以溶解到少量的缓冲溶液中,使用前采用缓冲溶液进行稀释, 也可以按照使用时的浓度溶解于缓冲溶液中储存。本发明对所述的医用组织封闭胶组合物 中的各组分的储存方式没有限制,所属技术领域人员可以根据需要,选择具体的储存方式, 均在本发明的范围之内。
[0041 ]另外,修饰有巯基的第一修饰产物具有更好的生物安全性,其对细胞的破坏作用 会进一步减弱,分子内二硫键增强了分子的刚性结构,减少与红细胞膜的接触面积。因此在 含有氨基的天然物质上修饰巯基后,具有更好的生物学特征,在人体内可以被完全降解。并 且还可以进一步与生物体内的蛋白质形成蛋白质复合物,从而具有特定的生物学功能。 [0042]本发明的医用组织封闭胶,所述第一组分中的活性基团与第二组分中的乙烯基的 摩尔比为1:1~1:3,优选1:2~1:3。优选地,当所述活性基团与乙烯基的摩尔比为1:2~1:3 时,乙烯基是过量的,多余的乙烯基可以与生物体组织表面的氨基和/或巯基键合,因此,具 有更加突出的粘附力。
[0043]当所述活性基团与乙烯基的摩尔比不在1:1~1:3的范围内时,例如氨基和/或巯 基的含量高于乙烯基时,没有多余的乙烯基与组织细胞接触面的氨基和/或巯基键合,所得 到的医用组织封闭胶与组织的粘附性较低;例如所述活性基团的含量低于乙烯基的含量1/ 3时,所形成的交联网络结构的强度和韧性较低,从而不利于形成具有高破裂强度的医用组 织封闭胶。
[0044] 本发明的医用组织封闭胶,其中,所述含有氨基的天然物质为壳聚糖、聚赖氨酸中 的一种或两种。由于壳聚糖、聚赖氨酸以及修饰有巯基的壳聚糖、修饰有巯基的聚赖氨酸具 有良好的生物相容性(例如血液相容性、组织相容性等)、安全性、生物降解性等优良性能, 从而可以减弱对细胞的破坏作用。
[0045] 另外,本发明的聚赖氨酸可以以其盐酸盐或其氢溴酸盐的形式进行反应,当然也 可以以其它盐或其它形式进行反应,均在本发明的范围内。本发明的聚赖氨酸可以为聚-L-赖氨酸、ε -聚赖氨酸中的一种或两种。
[0046] 根据本发明的医用组织封闭胶组合物,所述第一修饰产物是利用巯基化试剂在所 述含有氨基的天然物质上修饰巯基得到的;优选地,所述巯基化试剂为半胱氨酸、乙酰基半 胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种或多种;更优选地,所述巯基化试剂为巯基乙酸、巯基 丙酸、乙酰基半胱氨酸中的一种或多种。
[0047]具体而言,修饰有巯基的壳聚糖包括但不限于半胱氨酸壳聚糖(Cys-CHS)、乙酰基 半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS )、巯基乙酸壳聚糖(TGA-CHS )、巯基丙酸壳聚糖(MPA-CHS)中的一 种或多种;优选为巯基乙酸壳聚糖(TGA-CHS)、巯基丙酸壳聚糖(MPA-CHS)、乙酰基半胱氨酸 壳聚糖(NAC-CHS)中的一种或两种。所述乙酰基半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)的分子式(部分) 为:
[004!
[0 049」优选地,所还谷w m基的大然物质、所述第一修饰产物的重均分子量为3 0 0 0~ 5000Da0
[0050] 另外,本发明医用组织封闭胶的第二修饰产物优选为修饰有乙烯基的壳聚糖。并 且本发明中,所述壳聚糖的脱乙酰度不小于87.5%。
[0051] 本发明的医用组织封闭胶的成胶时间为1-120S,降解时间为10-180天,并且具有 交联网络结构。
[0052] 本发明还提供一种医用组织封闭胶,其由本发明的医用组织封闭胶组合物的第一 组分和第二组分反应后形成;优选地,所述医用组织封闭胶由所述第一组分和所述第二组 分在缓冲溶液中反应后形成。
[0053] 具体地,所述医用组织封闭胶由所述第一组分溶于第一缓冲溶液中,所述第二组 分溶于第二缓冲溶液中,然后混合、反应后形成。
[0054]优选地,用于溶解亲核试剂的所述第一缓冲溶液的pH值为7.5~12.5,优选8.0~ 10. 〇;用于溶解亲电试剂的所述第二缓冲溶液的pH值为2.6~6.5,优选3.5~6.0。
[0055] 本发明还提供一种医用组织封闭胶的制备方法,包括以下步骤:
[0056] 将所述第一组分溶于第一缓冲溶液中,得到第一混合液;
[0057]将所述第二组分溶于第二缓冲溶液中,得到第二混合液;
[0058] 将所述第一混合液与第二混合液混合,得到所述医用组织封闭胶。
[0059] 其中第一组分包括含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯 基的第一修饰产物;第二组分包括在壳聚糖和/或聚赖氨酸上修饰乙烯基的第二修饰产物。
[0060] 本发明的医用组织封闭胶组合物中的第一混合液和第二混合液混合后(例如可以 使用双联混合器混合),第一混合液中的亲核试剂(含有氨基的天然物质和/或第一修饰产 物)与第二混合液中的亲电试剂(第二修饰产物)发生迈克尔加成反应,可以快速成胶,从而 制得本发明的医用组织封闭胶。
[0061] 根据本发明的医用组织封闭胶的制备方法,其中,所述第一修饰产物制备方法包 括:
[0062] 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下,利用巯基化试剂在含有氨基的 天然物质上接枝巯基,得到所述第一修饰产物。即利用碳二亚胺类缩合剂及酰化催化剂将 巯基化试剂键合于含有氨基的天然物质上。
[0063] 举例而言,在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下,壳聚糖中的氨基与 乙酰基半胱氨酸中的羧基进行反应,脱去一分子水,从而得到乙酰基半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)。所述乙酰基半胱氨酸壳聚糖(NAC-CHS)的分子式(部分)为:
[0064:
[0065]根据本发明的医用组织封闭胶的制备方法,所述第二修饰产物的制备方法包括: 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下,在所述壳聚糖和/或聚赖氨酸接枝经活 化的丙烯酸类化合物,得到所述第二修饰产物,即:修饰有乙烯基的壳聚糖和/或聚赖氨酸。 丙烯酸由碳二亚胺类缩合剂和酰化试剂活化后,制备可以与氨基反应的羧基活性酰胺物 质,当反应结束后乙烯基被保留,从得制备得到乙烯基封端的壳聚糖或聚赖氨酸。
[0066] 碳二亚胺类缩合剂可以有效增强羧基官能团的活性,在通过碳二亚胺缩合剂活化 后的羧基,由于酰化催化剂的存在,可以进一步增强羧基物质的活性,有利于羧基活性酰胺 的反应活性的保持,使缩合反应稳定进行。
[0067] 所述丙烯酸类化合物可以为丙烯酸、戊烯酸中的一种或两种。当然本发明对丙烯 酸类化合物的具体结构没有限制,只要符合通式C = C-R-COOH即可。
[0068] 优选地,以所述氨基的摩尔数为基准,所述碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂的摩 尔数均是所述氨基的摩尔数的1~1 〇倍。
[0069]优选地,所述的碳二亚胺类缩合剂包括但不限于1-(3-二甲氨基丙基)-3_乙基碳 二亚胺盐酸盐(EDC)或其衍生物、N,N'_二异丙基碳二亚胺(DIC)或其衍生物、二环己基碳二 亚胺(DCC)或其衍生物中的一种或多种。
[0070] 优选地,所述的酰化催化剂包括但不限于4-二甲氨基吡啶(DMAP)及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶(4-PPY)及其衍生物、羟基苯并三唑(HOBt)及其衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS)及其衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(sulfo-NHS)及其衍生物中的一种或多种。
[0071] 利用碳二亚胺类缩合剂及酰化催化剂将丙烯酸类化合物键合于含有氨基的天然 物质上;由于碳二亚胺缩合的反应过程不太稳定,因此加入少量的酰化催化剂会促使反应 向正向移动。
[0072] 本发明的医用组织封闭胶的制备方法,所述第一缓冲溶液和/或第二缓冲溶液包 括但不限于磷酸盐溶液、碳酸盐溶液、硼酸盐溶液、磷酸溶液、乙酸溶液、盐酸溶液中一种或 多种。所述缓冲溶液的具体成分可根据第一组分或第二组分在缓冲溶液中的稳定性和成型 的组织封闭胶的理化性能情况进行选择,缓冲溶液不应含有有害或有毒的溶剂,通常选用 水做溶剂,缓冲液的渗透压应与生物体血液渗透压相同或接近。
[0073] 优选地,所述第一缓冲溶液包括但不限于pH值为8.0-10.0的四硼酸钠缓冲溶液或 pH为9.6~9.9的磷酸二氢钠溶液与碳酸钠溶液的组合的缓冲溶液;所述第二缓冲溶液包括 但不限于pH值为3.5-5.0的盐酸溶液、pH为5.0~6.0的磷酸钠缓冲溶液或pH为3.5-4.5的磷 酸二氢钠溶液和碳酸溶液的组合的缓冲溶液。
[0074] 本发明的医用组织封闭胶的制备方法,所述第一缓冲溶液液和/或第二缓冲溶液 中包含有显色剂;优选地,所述显色剂包含但不限于ro&C蓝色#1、FD&C蓝色#2、FD&C蓝色#3、 D&C绿色#6、亚甲基蓝中的一种或多种。
[0075] 本发明还提供一种医用组织封闭胶试剂盒,其包括本发明的医用组织封闭胶组合 物以及用于溶解医用组织封闭胶组合物的各组分的缓冲溶液。
[0076] 根据本发明所述的医用组织封闭胶试剂盒,其包括:第一组分、第二组分、第一缓 冲溶液和第二缓冲溶液,所述第一组分包括含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然 物质上修饰有疏基的第一修饰产物,所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独 立的具有10个以上的活性基团,其中,所述活性基团为氨基、巯基;在壳聚糖和/或聚赖氨酸 上修饰有10个以上乙烯基的第二修饰产物。
[0077] 根据本发明所述的医用组织封闭胶试剂盒,其中,所述第一组分和第二组分可以 是分离的,在使用时将第一组分和第二组分混合。在实际应用的过程中,所述第一组分和第 二组分可以分别单独储存,使用前或使用时再溶解于同一溶剂中。为了使用方便,也可以将 第一组分和/或第二组分分别在溶剂中预先溶解的形式储存,例如可以溶解到少量的缓冲 溶液中,使用前采用缓冲溶液进行稀释,也可以按照使用时的浓度溶解于缓冲溶液中储存。 本发明对所述的医用组织封闭胶组合物中的各组分的储存方式没有限制,所属技术领域人 员可以根据需要,选择具体的储存方式,均在本发明的范围之内。
[0078] 本发明还提供一种根据本发明的所述的医用组织封闭胶在伤口粘合制品、内脏或 软组织伤口闭合制品、脑脊液及组织液封堵制品、大面积创伤止血辅助物、软组织修复补片 与软组织粘合制品中的应用。
[0079] 另外,本发明中的成胶时间的测定方法为:将所述第一混合溶液与第二混合溶液 混合后开始计时,当混合后的二元混合物不再流动时即为成胶,此段时间记为成胶时间。
[0080] 本发明中的溶胀率的测试方法为:将制得的医用组织封闭胶置于精确度为万分之 一位的天平上,测得其重量为X g。然后将所述医用组织封闭胶置于pH=7.4的磷酸盐(PBS) 缓冲溶液中12小时,使得医用组织封闭胶达到溶胀平衡后取出,用滤纸擦干表面水分,再次 将其置于精确度为万分之一位的天平上,测得其重量为y g。重复测定十次,计算其平均值; 和?。按照以下公式计算溶胀率:溶胀率=(?- ?)/三X 100%。
[0081] 本发明中破裂强度的测定方法为:取新鲜猪皮或猪肠衣,其面积为20X20cm,将其 固定于只有一个开口的密闭箱的开口处,然后将所述密闭箱的开口密封,密闭箱的另一侧 连接有压力打气栗,并配有压力传感器。在所述猪皮或猪肠衣的中心位置切开一个直径为 0.5cm±0.02cm的小口,然后将人工硬脑膜或其他可封堵的材料置于小口表面,通过双联注 射器在封堵材料周围均匀的喷上所述第一混合溶液和所述第二混合溶液,喷涂后计时1至5 分钟,然后通过压力栗向密闭箱内打气,记录人工硬脑膜或其他封堵材料被顶开时压力传 感器的读数,即破裂强度。
[0082] 本发明中的降解时间的测定方法为:称取一定重量的医用组织封闭胶(例如 〇.5g),置于不可降解的聚丙烯网袋中,将其充分干燥后,放入pH=7.4的磷酸盐(PBS)缓冲 溶液中,然后置于恒温恒湿的37°C烘箱内。每隔24小时从缓冲溶液中取出一次样品,吸干其 表面水分并干燥样品后测试其重量,重量损失超过其原始重量5%时记为降解开始时间;重 量损失达到100 %时为完全降解时间。
[0083] 实施例
[0084]下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述,但是本领域技术人员将会 理解,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体 条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为 可以通过市购获得的常规产品。
[0085] 壳聚糖:Aladdin公司;产品编号:C105803。
[0086] 巯基丙酸:Aladdin公司;产品编号:M103035。
[0087] 可溶性碳二亚胺:Sigma-Aldrich公司;产品编号:MFCD00044916。
[0088] N-羟基琥珀酰亚胺(N-羟基丁二酰亚胺)=Sigma-Aldrich公司;产品编号:56480。 [0089] 聚-L-赖氨酸盐酸盐= Sigma-Aldrich公司;产品编号:P2658。
[0090] 4-arm-PEG-SG:厦门赛诺邦格生物科技有限公司,Mn = 10000。
[0091] 三聚赖氨酸乙酸盐:吉尔生化(上海)有限公司。
[0092] 丙烯酸:Aladdin公司,产品编号:A103525。
[0093] 实施例1
[0094]〈第一组分的制备〉
[0095] 1)称取脱乙酰度为87.5%的壳聚糖15111111〇1(2.4188),巯基丙酸20111111〇1(1.731^), 可溶性碳二亚胺20111111〇1(3.835(^),1羟基琥珀酰亚胺20臟〇1(2.301(^),置于温度为5°(:的 IOOmL纯化水中,搅拌反应8小时。
[0096] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中渗析12小时,以除去未反应 的单体及小分子物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0097] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到修饰有巯基的 壳聚糖,即为第一组分。
[0098]〈第二组分的制备〉
[0099] 1)称取脱乙酰度87 · 5 %的壳聚糖15mmo 1 (2 · 418g),丙烯酸20mmoI (1 · 4mL),可溶性 碳二亚胺20mmol(3.8350g),N_羟基琥泊酰亚胺20mmol(2.3010g),置于10°C的IOOmL纯化水 中,搅拌反应12小时。
[0100] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时,以除去未 反应单体及小分子物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0101] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到修饰有乙烯基 的壳聚糖,即为第二组分。
[0102] 〈医用组织封闭胶的制备〉
[0103] 1)称取第一组分1.5mmol (0.50g)溶于2.5mL磷酸二氢钠与碳酸钠混合的缓冲溶液 (ρΗ=9·97±0·02)中,称取第二组分1 · 5mmo I (0 · 50g)溶于2 · 5mL磷酸钠缓冲溶液(pH=5 · 64 ±0.02)中。
[0104] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出,得 到医用组织封闭胶I。
[0105] 实施例2
[0106]〈第一组分的制备〉
[0107] 1)称取重均分子量在3600~4300之间、伯胺基的摩尔百分含量为35 %的聚-L-赖 氨酸盐酸盐〇.4887g,其中伯胺基的摩尔质量为1.5mmol,疏基丙酸20mmol(l .73mL),可溶性 碳二亚胺20mmol(3.8350g),N-琥珀酰亚胺20mmol (2.3010g),置于温度为5°C的IOOmL纯化 水中,搅拌反应8小时。
[0108] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中渗析12小时,以除去未反应 的单体及小分子物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0109] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到修饰有巯基的 聚-L-赖氨酸,即为第一组分。
[0110]〈第二组分的制备〉
[0111] 1)称取脱乙酰度87.5%的壳聚糖15臟〇1(2.4188),丙烯酸2〇!11111〇1(1.41^),可溶性 碳二亚胺20mmol(3.8350g),N_羟基琥泊酰亚胺20mmol(2.3010g),置于5°C的IOOmL纯化水 中,搅拌反应8小时。
[0112] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时,以除去未 反应单体及小分子物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0113] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到修饰有乙烯基 的壳聚糖,即为第二组分。
[0114] 〈医用组织封闭胶的制备〉
[0115] 1)称取第一组分1.5mmol (0.50g)溶于2.5mL磷酸二氢钠与碳酸钠混合的缓冲溶液 (pH = 9 · 97 ±0 · 02)中,称取第二组分2 · Ommol (0 · 67g)溶于2 · 5mL磷酸二氢钠与碳酸混合的 缓冲溶液(ρΗ=3·64±0·02)中。
[0116] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出,得 到医用组织封闭胶II。
[0117] 实施例3
[0118] 〈第一组分的制备〉
[0119] 1)称取脱乙酰度为87.5%的壳聚糖15臟〇1(2.4188),置于温度为5°(:的1001^丙烯 酸(0.5mmol)水溶液中,搅拌反应8小时。
[0120] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中渗析12小时,以除去小分子 物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0121] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到水溶性壳聚 糖,即为第一组分。
[0122] 〈第二组分的制备〉
[0123] 1)称取脱乙酰度87.5%的壳聚糖15臟〇1(2.4188),丙烯酸2〇!11111〇1(1.41^),可溶性 碳二亚胺20mmol(3.8350g),N_羟基琥泊酰亚胺20mmol(2.3010g),置于5°C的IOOmL纯化水 中,搅拌反应8小时。
[0124] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时,以除去未 反应单体及小分子物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0125] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到修饰有乙烯基 的壳聚糖,即为第二组分。
[0126] 〈医用组织封闭胶的制备〉
[0127] 1)称取第一组分1.5mmol (0.50g)溶于2.5mL磷酸二氢钠与碳酸钠混合的缓冲溶液 (pH = 9 · 97 ±0 · 02)中,称取第二组分2 · Ommol (0 · 67g)溶于2 · 5mL磷酸二氢钠与碳酸混合的 缓冲溶液(ρΗ=3·64±0·02)中。
[0128] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出,得 到医用组织封闭胶III。
[0129] 实施例4
[0130]〈第一组分的制备〉
[0131 ] 1)选择重均分子量在3600~4300之间、伯胺基的摩尔百分含量为35 %的聚-L-赖 氨酸盐酸盐〇.4887g,其中伯胺基的摩尔质量为1.5mmol,即为第一组分。
[0132]〈第二组分的制备〉
[0133] 1)选择重均分子量在3600~4300之间、伯胺基的摩尔百分含量为35 %的聚-L-赖 氨酸盐酸盐〇.4887g,其中伯胺基的摩尔质量为I .5mmol,可溶性碳二亚胺20mmol (3.8350g),N-羟基琥珀酰亚胺20mmol (2.3010g),置于5°C的IOOmL纯化水中,搅拌反应8小 时。
[0134] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中进行渗析12小时,以除去未 反应单体及小分子物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0135] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到修饰有乙烯基 的聚-L-赖氨酸,即为第二组分。
[0136] 〈医用组织封闭胶的制备〉
[0137] 1)称取第一组分1.5mmol(0.50g)溶于2.5mL磷酸二氢钠与碳酸钠混合的缓冲溶液 (pH = 9 · 97 ±0 · 02)中,称取第二组分2 · Ommol (0 · 67g)溶于2 · 5mL磷酸二氢钠与碳酸混合的 缓冲溶液(ρΗ=3·64±0·02)中。
[0138] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出,得 到医用组织封闭胶IV。
[0139] 对比例1
[0140]〈第一组分的制备〉
[0141] 1)称取脱乙酰度为87.5%的壳聚糖15臟〇1(2.4188),置于温度为5°(:的1001^丙烯 酸(0.5mmol)水溶液中,搅拌反应8小时。
[0142] 2)将经步骤1)反应得到的混合物置于5L的生理盐水中渗析12小时,以除去小分子 物质,并且每隔2小时更换一次生理盐水。
[0143] 3)将经步骤2)渗析得到的混合物置于冻干机中进行冷冻干燥,得到水溶性壳聚 糖,即为第一组分。
[0144] 〈第二组分的制备〉
[0145] 称取重均分子量在3600~4300之间、伯胺基含量在聚-L-赖氨酸盐酸盐中的摩尔 百分含量为35%的聚-L-赖氨酸盐酸盐0.5087g,其中伯胺基的摩尔质量为1.6mmol,该聚-L-赖氨酸盐酸盐为第二组分。
[0146] 〈医用组织封闭胶的制备〉
[0147] 1)称取第一组分1.6mmol溶于2.5mL的磷酸二氢钠与碳酸钠混合的缓冲溶液(pH = 9.58 ± 0.02)中;称取第二组分3. Ommol (0.8g)溶于2.5mL磷酸二氢钠和碳酸混合的缓冲溶 液中(ρΗ=3·95±0·02)。
[0148] 2)将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分通过挤出装置等体积混合挤出,得 到医用组织封闭胶V。
[0149] 对比例2
[0150] 称取1.5mmo 1的三聚赖氨酸乙酸盐,溶于2.5mL的pH= 10.0的磷酸钠缓冲溶液中, 震荡使其完全溶解。
[0151] 称取2 · Ommol的4-arm-PEG-SG,溶于2 · 5mL的pH=4 · 0的硼砂缓冲溶液中,震荡使其 完全溶解。
[0152] 将经缓冲溶液溶解后的三聚赖氨酸乙酸盐和4-arm-PEG-SG通过挤出装置等体积 混合挤出,得到医用组织封闭胶VI。
[0153] 对比例3
[0154] 称取I · 5mmol的4-arm-PEG-NH2,溶于2 · 5mL的pH= 10 · 0的磷酸钠缓冲溶液中,震荡 使其完全溶解。
[0155] 称取2 · Ommol的4-arm-PEG-SG,溶于2 · 5mL的pH=4 · 0的硼砂缓冲溶液中,震荡使其 完全溶解。
[0156] 将经缓冲溶液溶解后的4-arm-PEG-NH2和4-arm-PEG-SG通过挤出装置等体积混合 挤出,得到医用组织封闭胶VII。
[0157] 测定上述实施例1-4和对比例1-3的成胶时间,溶胀率、破裂强度、剥离拉伸承载强 度、开始降解时间以及完全降解时间,结果如下表1所示:
[0158] 表1
[0160] 从表1可以看出,对比例1中未修饰有乙烯基的聚赖氨酸与天然的壳聚糖不能交联 形成医用组织封闭胶;本发明实施例1-4制备得到的医用组织封闭胶I-IV与对比例2-3的组 织封闭VI-VII胶相比,本发明的医用组织封闭胶I-IV具有较高的破裂强度和剥离拉伸承载 强度,并且具有较低的溶胀率。因此本发明的医用组织封闭胶具有较好的抗破裂强度和粘 合力,在组织封闭、创面闭合、防止组织液、血液或脑脊液泄漏方面具有更好的优势。同时由 于具有较低的溶胀率,可应用于脑膜等较狭窄及神经分布较多的部位。
[0161] 人工硬脑膜修补实验
[0162] 采用按照实施例2的方法制备得到的经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分进 行动物实验。
[0163] 取10只健康的新西兰兔作为实验兔,随机标号T1,T2,T3,T4,T5,T6,T7,T8,T9, Τ10。将实验兔麻醉后在其头顶制造1.5cmX0.5cm的硬脑膜缺口,然后进行人工硬脑膜修补 手术,其中Tl~T5为实验组,T6~TlO为对照组,实验组Tl~T5植入人工硬脑膜,通过两组分 注射器将经缓冲溶液溶解后的第一组分和第二组分混合后,喷涂于人工硬脑膜材料周围及 表面,30秒后检查其交联情况,待两组分完全交联形成医用组织封闭胶II后将伤口封闭缝 合。图1为实验组T5接受硬脑膜修补术后,将医用组织封闭胶II喷涂于人工硬脑膜周围后的 照片。对照组T6~TlO在植入人工硬脑膜后不进行喷涂,直接将伤口封闭缝合。
[0164] 手术一周后观察,所有的实验兔均保持健康。解剖实验组Tl和T2的实验兔以及对 照组T6和T7的实验兔后发现:对照组T6和T7的实验兔均发生了人工硬脑膜侧向移动或与附 着位置脱离现象;实验组Tl和T2的实验兔在用组织密封胶封闭II后均未发生人工硬脑膜移 动问题。
[0165] 手术两周后观察,所剩余的实验兔均保持健康。解剖观察实验组Τ3和对照组Τ8实 验兔后发现:对照组Τ8的实验兔发生了人工硬脑膜侧向移动,堆积至一侧并发生脑脊液泄 漏;实验组Τ3在用组织密封胶封闭II后均未发生人工硬脑膜移动,组织封闭胶的颜色变淡 并可观察到已发生明显的降解。
[0166] 手术四周后观察,剩余的实验兔均存活,解剖观察实验组Τ4,Τ5和对照组T9,TlO实 验兔后发现:对照组Τ9,Τ10已发生明显的脑脊液外漏问题;实验组Τ4,Τ5中的组织密封胶已 完全降解,消失不见,且并未发生脑脊液外漏的问题。
[0167] 另外,在实验组Tl~Τ5中所有的实验兔身上都没有发现神经缺陷,从最初的手术 操作开始所有的实验兔均保持健康。
[0168] 上述结果表明,当将本发明的可生物降解的组织密封胶可以有效地应用在人工硬 脑膜及邻近组织上,实现组织封闭,防止脑脊液泄露。
[0169] 自体硬脑膜修复实验
[0170]将实施例2的医用组织封闭胶II应用于自体硬脑膜修复,两个月后取出修复部位 组织做病理切片,采用苏木精-伊红染色后在显微镜下观察。图2是医用组织封闭胶II应用 于自体硬脑膜修复部位的组织切片图,如图2所示,医用组织封闭胶II已完全降解,并且医 用组织封闭胶II与硬脑膜接触位置未见炎症细胞,硬脑膜组织无变性,无坏死,无纤维化增 生。另外,硬脑膜周围其它组织细胞也未见细胞变性和坏死等病理改变。因此,本发明的医 用组织封闭胶具有良好的组织相容性,可完全生物降解。
[0171] 细胞毒实验
[0172]通过浸提液接触培养细胞,以L929为实验细胞,对细胞增殖观察,评价实施例2所 制备的医用组织封闭胶II对体外细胞的毒性作用。
[0173] 实验的具体过程为:用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS) + 1%双抗(青 霉素和链霉素的混合液))按照0.1g/mL的比例浸提医用组织封闭胶,得到组织封闭胶的浸 提液。
[0174] 实验组:采用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1 %双抗(青霉素和链 霉素的混合液),添加组织封闭胶的浸提液,加入细胞悬液,进行细胞培养。
[0175] 对照组:采用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1 %双抗(青霉素和链 霉素的混合液))加入细胞悬液,进行细胞培养。对照组中不添加组织封闭胶的浸提液,其余 细胞培养条件与实验组相同。
[0176] 空白组:采用完全培养基(DMEM培养基+10%胎牛血清(FBS)+1 %双抗(青霉素和链 霉素的混合液),空白组中不添加组织封闭胶的浸提液和细胞悬液,于相同的时间放置于与 实验组和对照组相同的环境中,以作为实验组和对照组测量吸光度值时的参照。
[0177] 采用实施例2的医用组织封闭胶II进行浸提液的配制,浸提温度为(37±1)°C,浸 提时间为(24±2)h。采用完全培养基重悬L929细胞,制得浓度为4 X IO4个细胞/mL的细胞悬 液。以96孔平板为培养板,其中实验组和对照组为在培养板中加入上述细胞悬液,每孔加入 I OOyL;空白组为在培养板中每孔加入I OOyL的完全培养基,不加入细胞悬液。
[0178] 将实验组、对照组和空白组的培养板置于培养箱中预培养24小时(在37°C,5%CO2 的条件下)。然后在实验组中加入组织封闭胶的浸提液,每孔加入i〇〇yL,对照组和空白组不 加组织封闭胶的浸提液,之后将各培养板置于培养箱中培养24小时(在37°C,5%C〇2条件 下)。然后吸出孔内的培养液,再向每孔内加入IOOyL的CCK-8混合液(由90yL的完全培养基+ I OyL的CCK-8混合制成),再将培养板置于培养箱中孵育2小时。然后用酶标仪测定在450nm 处的吸光度。
[0179] 图3为细胞毒实验中,实验组、对照组分别减去空白组后(即以空白为参照)的吸光 度值(OD值)。由图3可以得出,实验组细胞的相对增殖率为RGR = 94.92 %。
[0180] 其中,实验组细胞的相对增殖率RGR的计算方法为:RGR=(实验组OD值-空白组OD 值)/(对照组OD值-空白组OD值)X 100%。因此,本发明的医用组织封闭胶具有良好的安全 性,对细胞生长无毒副作用。

1. 一种医用组织封闭胶组合物,其特征在于,包括:第一组分和第二组分,其中, 所述第一组分包括:含有氨基的天然物质和/或在含有氨基的天然物质上修饰有巯基 的第一修饰产物,所述含有氨基的天然物质和所述第一修饰产物各自独立的具有10个以上 的活性基团,其中,所述活性基团为氨基、巯基; 所述第二组分包括:在壳聚糖和/或聚赖氨酸上修饰有10个以上乙烯基的第二修饰产 物。2. 根据权利要求1所述的医用组织封闭胶组合物,其特征在于,所述第一组分中的活性 基团与所述第二组分中的乙烯基的摩尔比为1:1~1:3,优选1:2~1:3。3. 根据权利要求1或2所述的医用组织封闭胶组合物,其特征在于,所述第二修饰产物 为修饰有乙烯基的壳聚糖。4. 根据权利要求1-3任一项所述的医用组织封闭胶组合物,其特征在于,所述含有氨基 的天然物质为壳聚糖、聚赖氨酸中的一种或两种。5. 根据权利要求1-4任一项所述的医用组织封闭胶组合物,其特征在于,所述第一修饰 产物是利用巯基化试剂在所述含有氨基的天然物质上修饰巯基得到的;优选地,所述巯基 化试剂为半胱氨酸、乙酰基半胱氨酸、巯基乙酸、巯基丙酸中的一种或多种;更优选地,所述 巯基化试剂为巯基乙酸、巯基丙酸、乙酰基半胱氨酸中的一种或多种。6. 根据权利要求1-5任一项所述的医用组织封闭胶组合物,其特征在于,所述含有氨基 的天然物质、所述第一修饰产物的重均分子量为3000~5000Da。7. -种医用组织封闭胶,其由权利要求1-6任一项所述的医用组织封闭胶组合物的第 一组分和第二组分反应后形成;优选地,所述医用组织封闭胶由所述第一组分和所述第二 组分在缓冲溶液中反应后形成。8. 根据权利要求7所述的医用组织封闭胶,其特征在于,所述医用组织封闭胶由所述第 一组分溶于第一缓冲溶液中,所述第二组分溶于第二缓冲溶液中,然后混合、反应后形成。9. 一种根据权利要求7或8所述的医用组织封闭胶的制备方法,其特征在于,包括以下 步骤: 将所述第一组分溶于第一缓冲溶液中,得到第一混合液; 将所述第二组分溶于第二缓冲溶液中,得到第二混合液; 将所述第一混合液与第二混合液混合,得到所述医用组织封闭胶。10. 根据权利要求9所述的医用组织封闭胶的制备方法,其特征在于,所述第二修饰产 物的制备方法包括: 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下,在所述壳聚糖和/或聚赖氨酸上接 枝经活化的丙烯酸类化合物,得到所述第二修饰产物。11. 根据权利要求9或10所述的医用组织封闭胶的制备方法,其特征在于,所述第一修 饰产物的制备方法包括: 在碳二亚胺类缩合剂和酰化催化剂存在的条件下,利用巯基化试剂在所述含有氨基的 天然物质上接枝巯基,得到所述第一修饰产物。12. 根据权利要求10或11所述的医用组织封闭胶的制备方法,其特征在于,所述碳二亚 胺类缩合剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及其衍生物、N,N'_二异丙基碳 二亚胺及其衍生物、二环己基碳二亚胺及其衍生物中的一种或多种。13. 根据权利要求10-12任一项所述的医用组织封闭胶的制备方法,其特征在于,所述 酰化催化剂为4-二甲氨基吡啶及其衍生物、4-吡咯烷基吡啶及其衍生物、羟基苯并三唑及 其衍生物、N-羟基琥珀酰亚胺及其衍生物、N-羟基硫代琥珀酰亚胺及其衍生物中的一种或 多种。14. 一种医用组织封闭胶试剂盒,其特征在于,其包括权利要求1-6任一项所述的医用 组织封闭胶组合物以及用于溶解所述医用组织封闭胶组合物的各组分的缓冲溶液。15. -种根据权利要求7或8所述的医用组织封闭胶在伤口粘合制品、内脏或软组织伤 口闭合制品、脑脊液及组织液封堵制品、大面积创伤止血辅助物、软组织修复补片与软组织 粘合制品中的应用。
C08F283/04GK106075550SQ201610447130
2016年11月9日
2016年6月17日
马骋, 邓坤学, 袁玉宇
广州迈普再生医学科技有限公司

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