推荐低麸质酵母水解物的制作方法

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本发明涉及低麸质酵母水解物以及使用脯氨酰基特异性内切蛋白酶产生所述低麸质酵母水解物的方法。发明背景为产生酵母提取物,典型地可以使面包酵母和圆酵母细胞经受自溶。一些酵母来源(例如用过的啤酒酵母)含有麸质(麦醇溶蛋白(gliadins))残留物。因此,源于含有麦醇溶蛋白的酵母来源的提取物和悬浮液在食品中的应用有限,这是由于部分人口对麦醇溶蛋白的不耐受(乳糜泻)造成的。观察到从含有麦醇溶蛋白的来源获得的典型酵母提取物或自溶物(例如啤酒酵母提取物)含有按重量计浓度超过20ppm的可接受阈值的麦醇溶蛋白。减少来自含有麦醇溶蛋白的酵母来源的麦醇溶蛋白使得能够在需要不存在低浓度麸质的食品应用中使用这些酵母及其提取物。减少酵母中的麦醇溶蛋白的一个问题在于特异性地降低麦醇溶蛋白含量,而不存在该处理的不希望的副作用。例如,不希望旨在降低麦醇溶蛋白含量的处理也降解酵母的RNA。现在出人意料地发现,可以通过在水解和/或自溶过程中用脯氨酸特异性内切蛋白酶进行孵育而从含有麦醇溶蛋白的酵母来源中去除麦醇溶蛋白。出人意料地发现,可以将麦醇溶蛋白有效地水解至基于酵母自溶物和提取物的干物质含量按重量计低于20ppm的水平。另外,发现在水解和/或自溶过程中用脯氨酸特异性内切蛋白酶进行孵育不会降解存在于酵母中的RNA。定义“酵母”在本文中被定义为包含酵母细胞的固体、糊体或液体组合物。优选地,酵母细胞来自Saccharomyces属。酵母可以在发酵过程(如用于产生常见面包酵母(baker’syeast)的过程)中产生。优选地,酵母是啤酒酵母(brewer’syeast),如可以作为侧流从啤酒酿造过程中获得的用过的啤酒酵母。“自溶”在本文中被定义为使用内源酵母酶和任选地外源加入的酶使酵母细胞进行的酶促分解。自溶可以产生酵母自溶物和酵母提取物两者(参见下文的定义)。“水解”在本文中被定义为仅使用外源酶使酵母细胞进行酶促分解。首先通过例如热激使内源酵母酶失活。水解也可以产生酵母自溶物和酵母提取物两者(参见下文的定义)。“酵母水解物”在本文中被定义为通过如在上文定义的并且产生如在下文定义的酵母自溶物或酵母提取物的自溶或水解获得的酵母(如用过的啤酒酵母)消化物。“酵母自溶物”是从啤酒酵母细胞(优选地用过的啤酒酵母细胞)中获得的经浓缩的、未经提取的、部分可溶的消化物。通过如在上文定义的酵母细胞的水解或自溶来完成消化。啤酒酵母自溶物含有源于完整酵母细胞的可溶和不可溶两种组分(例如食品化学药典)。“酵母提取物”仅包含啤酒酵母细胞的水溶性组分,其构成主要是氨基酸、肽、碳水化合物和盐。酵母提取物通过由存在于食用酵母中的天然存在的酶和/或通过加入食品级酶(食品化学药典)水解肽键(即,通过如在上文定义的自溶和/或水解)来产生。“蛋白酶”在本文中被定义为以内切方式作用于蛋白质底物中的肽键(即切割多肽链中任何位置的肽键)的水解酶,这与(外)肽酶不同,所述(外)肽酶在本文中被定义为以外切方式作用于蛋白质底物中的肽键(即在多肽链末端附近起作用)的水解酶:氨肽酶是从多肽链的N-末端侧切掉氨基酸、二-、三-或更高寡肽,并且羧肽酶是从多肽链的C-末端侧切掉氨基酸、二-、三-或更高寡肽。基于其催化机制将内切蛋白酶分为以下亚类:丝氨酸内切蛋白酶(EC3.4.21.xx)、半胱氨酸内切蛋白酶(EC3.4.22.xx)、天冬氨酸内切蛋白酶(EC3.4.23.xx)和金属内切蛋白酶(EC3.4.24.xx)。“脯氨酸特异性内切蛋白酶”在本文中被定义为在蛋白质或寡肽底物中的脯氨酸残基的C-末端侧切割蛋白质或寡肽底物的内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶已被分类为EC3.4.21.26。所述酶可以从多种来源如哺乳动物来源、细菌(例如Flavobacterium)和真菌(Aspergillus,特别是Aspergillusniger)获得。Aspergillusniger的酶已被详细描述于WO02/45524、WO02/46381、WO03/104382中。来自Penicilliumchrysogenum的适合的真菌酶披露于WO2009/144269中。来自Flavobacteriummeningosepticum的适合的细菌酶披露于WO03068170中。“麸质”在本文中被定义为在谷物中发现的蛋白复合物并且被再分为麦醇溶蛋白和麦谷蛋白(glutenin)。发明详述在第一方面,本发明提供了用于制备酵母水解物的方法,其特征在于该方法包括以下步骤:使含有麸质的酵母水解物与脯氨酸特异性内切蛋白酶接触,产生基于无盐酵母干物质包含少于100ppm麸质或麦醇溶蛋白的酵母水解物。优选地,基于无盐酵母干物质,所得酵母水解物包含少于50ppm的麸质或麦醇溶蛋白,更优选地少于40ppm、更优选地少于30ppm且更优选地少于20ppm的麸质或麦醇溶蛋白。酵母水解物可以优选地含有至少5ppm的麸质或麦醇溶蛋白,更优选地至少4ppm的麸质或麦醇溶蛋白、更优选地至少3ppm的麸质或麦醇溶蛋白、更优选地至少2ppm的麸质或麦醇溶蛋白。最优选地,基于无盐酵母干物质,酵母水解物含有至少1ppm的麸质。本发明的发明人出人意料地发现,本发明脯氨酸特异性内切蛋白酶提供了低麸质酵母水解物,其中酵母的RNA或衍生的5’核糖核苷酸不被或基本上不被降解,并且因此可用于转化成增强味道的5’-核糖核苷酸。可以在本发明的方法中使用任何脯氨酸特异性内切蛋白酶。脯氨酸特异性内切蛋白酶可以来自于哺乳动物、植物或微生物。适合的微生物脯氨酸特异性内切蛋白酶来自细菌(如Flavobacteriummeningosepticum)或来自真菌(如Penicilliumchrysogenum或Aspergillusniger)。在一个优选实施方案中,本发明的方法使用Aspergillusniger的脯氨酸特异性内切蛋白酶。这种酶可作为Brewer’sClarex商购并且可以从荷兰代尔夫特的DSMFoodSpecialties获得。其中脯氨酸特异性内切蛋白酶用于降低酵母水解物的麸质含量的步骤的条件(如pH和温度)可以因脯氨酸特异性内切蛋白酶的不同而不同,但是可以由本领域技术人员无过度负担地基于在本领域中已知的各种脯氨酸特异性内切蛋白酶的酶特性来选择。优选地,基于无盐酵母干物质,与本发明的含有麸质的酵母水解物相接触的脯氨酸特异性内切蛋白酶的量在多于零至0.5%w/w的范围内。更优选地,基于无盐酵母干物质,与本发明的含有麸质的酵母水解物相接触的脯氨酸特异性内切蛋白酶的量在0.01至0.5w/w的范围内,更优选地在0.02至0.1w/w或至0.01w/w的范围内。酵母水解物可以是在上文中定义的酵母提取物或酵母自溶物。酵母可以是任何适合的酵母并且优选地选自Saccharomyces、Brettanomyces、Kluyveromyces、Candida或Torula属,优选Saccharomyces属,更优选被用作面包酵母的Saccharomycescerevisiae或在酿造工业中例如被用于生产窖藏啤酒的啤酒酵母Saccharomycescarlsbergensis或与其同义的Saccharomycespastorianus。在一个优选实施方案中,酵母是啤酒酵母并且更优选作为啤酒酿造过程的副产物的用过的啤酒酵母。酵母水解物可以通过本领域公知的方法(如在上文中定义的自溶或水解)产生自酵母细胞。酵母细胞可以含有麸质,例如因为在酵母的产生过程中使用了含有麸质的原料。特别地,啤酒酵母(更优选用过的啤酒酵母)可以含有来自在啤酒酿造过程中使用的大麦或小麦的残留麸质。在本发明的方法中,制备了基于无盐酵母干物质包含少于100ppm的麸质或麦醇溶蛋白的酵母水解物。优选地,基于无盐酵母干物质,所得酵母水解物包含少于50ppm的麸质或麦醇溶蛋白,更优选地少于40ppm、更优选地少于30ppm且更优选地少于20ppm的麸质或麦醇溶蛋白。在该方法中使用的脯氨酸特异性内切蛋白酶通过以上文对脯氨酸特异性内切蛋白酶所描述的特异性切割麸质而减少存在于酵母水解物中的麸质的量。本领域技术人员将容易地理解,为了获得具有少于100ppm麸质的酵母水解物,经受利用脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤的酵母水解物必须含有多于100ppm,否则脯氨酸特异性内切蛋白酶无法降低麸质含量。类似地,为了获得具有少于50ppm麸质的酵母水解物,经受利用脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤的酵母水解物必须含有多于50ppm;并且同样地,为了获得具有少于40ppm麸质的酵母水解物,经受利用脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤的酵母水解物必须含有多于40ppm;并且同样地,为了获得具有少于30ppm麸质的酵母水解物,经受利用脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤的酵母水解物必须含有多于30ppm;并且同样地,为了获得具有少于20ppm麸质的酵母水解物,经受利用脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤的酵母水解物必须含有多于20ppm。通常,与其中脯氨酸特异性内切蛋白酶降低麸质含量的步骤之后获得的酵母水解物相比,经受利用脯氨酸特异性内切蛋白酶的步骤的酵母水解物必须含有更多的麸质。进一步优选的是,在使含有麸质的酵母水解物与脯氨酸特异性内切蛋白酶接触产生基于无盐酵母干物质包含少于100ppm的麸质且至少1ppm的麸质的酵母水解物的本发明步骤中还包括用以产生5’-核糖核苷酸的磷酸二酯酶以及任选地用以将5’-AMP转化为5’-IMP的酶处理。使用磷酸二酯酶与本发明脯氨酸特异性内切蛋白酶的组合的优势在于获得具有增加量的5’-核糖核苷酸的低麸质酵母水解物。在第二方面,本发明提供了基于无盐酵母干物质包含少于100ppm麸质或麦醇溶蛋白的酵母水解物。优选地,基于无盐酵母干物质,所得酵母水解物包含少于50ppm的麸质或麦醇溶蛋白,更优选地少于40ppm、更优选地少于30ppm且更优选地少于20ppm的麸质或麦醇溶蛋白。酵母水解物可以优选地含有至少5ppm的麸质,更优选地至少4ppm的麸质或麦醇溶蛋白、更优选地至少3ppm的麸质或麦醇溶蛋白、更优选地至少2ppm的麸质或麦醇溶蛋白。最优选地,基于无盐酵母干物质,酵母水解物含有至少1ppm的麸质或麦醇溶蛋白。酵母水解物可以是通过任何适合的方法可获得的,但是优选地是通过本发明的第一方面的方法可获得的或获得的。在第一或第二方面的一个优选实施方案中,本发明中的酵母水解物进一步包含5’-核糖核苷酸。术语“5’-核糖核苷酸”在本文中旨在指游离5’-核糖核苷酸或其盐。5’-IMP、5’-GMP因其风味增强的特性而闻名。它们能够在某些类型的食品中增强可口且美味的味道。因此,本发明中酵母水解物的优势在于它提供了与低量的麦醇溶蛋白和/或麸质组合的风味增强特性。5’-核糖核苷酸在本发明的酵母水解物中的重量百分比(%w/w)是基于无氯化钠的酵母水解物干物质的重量并且作为5’-核糖核苷酸的二钠盐七水合物(2Na.7H2O)来计算。在第一或第二方面的另一优选实施方案中,本发明中的酵母水解物进一步包含5’-GMP(5’-单磷酸鸟苷)和/或5’-IMP(5’-单磷酸肌苷)。优选地,本发明中的酵母水解物包含多于60%、优选多于70%、更优选多于80%、更优选多于90%、更优选多于95%的下述量的5’-GMP和/或5’-IMP,所述量为从酵母水解物所获得自的酵母细胞中存在的给定RNA量能够获得的最大的5’-GMP和/或5’-IMP量。优选地,基于无氯化钠的酵母水解物干物质,本发明中酵母水解物中的5’-GMP和5’-IMP的总量是至少1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5、4%、5%或至少6%。如果酵母水解物是酵母自溶物,则基于无氯化钠的酵母自溶物干物质,5’-GMP和5’-IMP的总量是至少1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5、4%、5%或至少6%。如果本发明中的酵母水解物是酵母提取物,则基于无氯化钠的酵母提取物干物质,5’-GMP和5’-IMP的总量是至少1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5、4%、5%或至少6%。优选地,基于无氯化钠的酵母自溶物或酵母提取物干物质,本发明酵母自溶物或酵母提取物中的5’-GMP和5’-IMP的总量少于10%,优选地少于6%,更优选地少于5%或少于4%。本发明第二方面中的酵母水解物可以是在上文中所定义的酵母提取物或酵母自溶物。酵母可以是任何适合的酵母并且优选地选自Saccharomyces,Brettanomyces,Kluyveromyces,Candida或Torula属,优选Saccharomyces属,更优选被用作面包酵母的Saccharomycescerevisiae或在酿造工业中例如被用于生产窖藏啤酒的啤酒酵母Saccharomycescarlsbergensis或与其同义的Saccharomycespastorianus。在一个优选实施方案中,酵母是啤酒酵母并且更优选作为啤酒酿造过程中副产物的用过的啤酒酵母。在第三方面,本发明提供了根据本发明第二方面的酵母水解物或酵母提取物或酵母自溶物在过程风味反应(processflavourreaction)中、在肉类应用中、或作为风味增强剂、或作为风味改良剂、或在头香载体(topnotecarrier)中或在桌面应用品(table-topapplication)中的用途。在第四方面中,本发明提供了包含根据本发明的第二方面的酵母水解物或酵母提取物或酵母自溶物的风味增强剂、肉制品、风味改良剂、头香载体或桌面应用品。材料和方法麸质测定通过麸质/麦醇溶蛋白的UPEX-提取(通用醇溶谷蛋白和谷蛋白提取溶液(UniversalProlaminandGlutelinExtractantsolution))并且通过基本上如M.C.Mena等人,Talanta91(2012)pp33–40“ComprehensiveanalysisofgluteninprocessedfoodsusinganewextractionmethodandacompetitiveELISAbasedontheR5antibody”中描述的ELISA试验定量来测定酵母水解物中的麸质的量。麸质提取程序是基于PBS(Sigma-Aldrich货号:P3813,荷兰)中的还原型三(2-羧乙基)-膦(TCEP)(Sigma-Aldrich货号:C4706,荷兰)和阴离子表面活性剂N-月桂酰肌氨酸(十二烷基肌酸钠)(Sigma-Aldrich货号:61745,荷兰)试剂。1.称取250mg干酵母水解物并转移到10ml聚丙烯管中。2.向含有酵母水解物的管中加入2.5mlUPEX溶液(PBS(pH7)中的5mMTCEP、2%N-月桂酰肌氨酸)。为了防止还原剂失活,在使用之前即刻制备UPEX溶液。3.将管紧闭,并且将帽用膜覆盖以避免蒸发。4.将管的内容物通过涡旋5至10秒充分混合,并且将管置于试管架上。5.将管在50℃下在GL水浴型号1003中孵育40分钟。6.允许管在室温下冷却5分钟。7.加入7.5ml的80%乙醇/水(v/v),并且将样品通过涡旋10–60秒而彻底地分散直到实现样品完全分散,然后在室温下在旋转(头顶式)振荡器(StuartScientificRollermixer型号:SRT2)中以45转/分钟孵育1小时。8.将管在室温下在台式离心机(Eppendorf型号5810R)中以2500g离心10分钟。9.使用新巴氏移液管,将来自每个管的上清液转移到干净的10ml聚丙烯管中。10.在提取24小时内,通过ELISA试验对溶液进行分析。为了进行ELISA试验,使用由R-Biopharm供应的麦醇溶蛋白竞争性试剂盒(R-BiopharmAG,德国达姆施塔特)。实施例实施例1减少麦醇溶蛋白用过的啤酒酵母膏源自荷兰的酿酒厂。将获得的酵母加热至55℃并且将pH值设为5.3。向浆料中加入基于酵母无盐干物质1%w/w用量的(含有Bacilluslicheniformis的内切蛋白酶枯草溶菌素(subtilisinCarlsberg)并且由丹麦的诺维信生产并且购自Sigma,目录号P4860)。将悬浮液孵育过夜。孵育之后,将悬浮液设为pH为5.3并且分为4个不同的部分。根据表1,基于无盐干物质,给予0至0.5%w/w范围的脯氨酸特异性内切蛋白酶。将悬浮液维持在61℃下并孵育15小时。孵育之后,将悬浮液加热,以终止残留酶的活性。取悬浮液和提取物(澄清悬浮液之后)的样品并通过蒸发进行浓缩。通过如在材料和方法中描述的UPEX提取和ELISA试验分析浓缩物的麦醇溶蛋白含量。表1:脯氨酸特异性内切蛋白酶的剂量效应实施例2减少麦醇溶蛋白将粉末剂型的啤酒酵母提取物(EXPRESA2200S,DSMFOODSPECIALTIES,荷兰代尔夫特)溶于水中至10%w/w。将溶液的pH值设为5.3,并且将温度维持在61摄氏度。将样品分为两部分。将脯氨酸特异性内切蛋白酶加入两个含有酵母提取物的烧瓶之一中,并且基于无盐酵母干物质给予0.5%w/w。将溶液孵育15小时。孵育之后,将溶液加热至90℃,以终止残留酶活性。将获得的溶液通过水蒸发进行浓缩。使用浓缩的样品,通过在材料和方法中描述的UPEX提取和ELISA试验分析其麦醇溶蛋白含量。表2:脯氨酸特异性内切蛋白酶的作用实施例3与蛋白酶相比脯氨酸特异性内切蛋白酶的RNA的减少在这个实施例中,将用脯氨酸特异性内切蛋白酶降低麦醇溶蛋白含量之后的不希望的RNA降解与用可商购的也适于降低麦醇溶蛋白含量的蛋白酶进行的处理进行比较。获自荷兰啤酒厂的啤酒酵母用于以高酵母增溶产率产生含有核苷酸的酵母自溶物。测量酵母RNA并且基于干物质是3.4%。首先,将酵母在95℃下热激5分钟。随后通过两个蛋白酶步骤将干物质溶解。第一步,将(含有Bacilluslicheniformis的内切蛋白酶枯草溶菌素并且由丹麦诺维信生产并且购自Sigma,目录号P4860)在pH值为8且温度为62℃的条件下孵育6小时(用量:基于干物质是0.8%)。对于第二蛋白酶处理,对若干不同的酶进行测试:·Proteax(可获得自AmanoEnzyme)·肽酶R(可获得自AmanoEnzyme)·Accelerzyme(可获得自DSM)·SumizymeFP(可获得自ShinNihon)·脯氨酸特异性内切蛋白酶(BrewersClarex,来自DSM)将这些蛋白酶分开应用于不同的实验中(1%,基于干物质),并且在pH为5.2且温度为51.5℃的条件下孵育15小时。这两个蛋白酶步骤之后,通过85℃热激使酶失活。通过用5’-磷酸二酯酶(DSM)和脱氨酶(Amano)孵育来转化RNA,以产生5’GMP和5’IMP。孵育是在pH值为5.3且温度为60℃的条件下进行15小时。这些不同的处理之后,随后根据以下方法通过HPLC测定样品中5’-GMP和5’-IMP的量(被表示为基于无氯化钠干物质的其二钠七水合物的重量百分比)。通过使用WhatmanPartisil10-SAX柱、作为洗脱液的磷酸盐缓冲液(pH3.35)的HPLC和UV检测来对5’-GMP和5’-IMP进行定量。在5’-GMP和5’-IMP标准品的基础上计算浓度。通过用Jenway氯计PCLM3(Jenway,英格兰埃塞克斯)测量样品中的氯离子并计算氯化钠的对应量来测定氯化钠。通过测定增溶产率和蛋白质的水解程度来测量蛋白酶的效力。结果汇总于表3中:表3:1.通过DM上清液/DM培养液进行计算2.通过HPLC测量酸水解之后的游离氨基酸/总氨基酸进行计算表3显示,考虑到起始酵母的RNA含量(3.4%),使用脯氨酸特异性内切蛋白酶提供了5’-GMP和5’-IMP预期量的至少90%的5’-GMP和5’-IMP。因此,如在实施例1和2中所示的,脯氨酸特异性内切蛋白酶能够减少麸质,同时存在于酵母中的RNA不被降解,并且因此可用于转化为5’-核糖核苷酸(如5’-GMP和5’-IMP)。鉴于其他蛋白酶的5’-GMP和5’-IMP量,这是出人意料的,因为所述其他酶显然还降解酵母RNA。当前第1页1 2 3 当前第1页1 2 3 
技术特征:

1.一种用于制备酵母水解物的方法,其特征在于所述方法包括以下步骤:使含有麸质的酵母水解物与脯氨酸特异性内切蛋白酶接触,产生基于无盐酵母干物质包含少于100ppm的麸质且至少1ppm的麸质的酵母水解物。

2.根据权利要求1所述的方法,其中基于无盐酵母干物质,所得的所述酵母水解物包含少于50ppm的麸质,更优选地少于40ppm、更优选地少于30ppm且更优选地少于20ppm的麸质。

3.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述脯氨酸特异性内切蛋白酶被分类为EC 3.4.21.26。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来源于哺乳动物或植物或微生物,优选细菌或真菌。

5.根据权利要求4所述的方法,其中所述脯氨酸特异性内切蛋白酶是真菌脯氨酸特异性内切蛋白酶,优选地来自Penicillium物种或来自Aspergillus物种。

6.根据权利要求5所述的方法,其中所述脯氨酸特异性内切蛋白酶来自Aspergillus niger。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酵母水解物是酵母提取物或酵母自溶物。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酵母水解物是用过的啤酒酵母水解物。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述酵母是来自Saccharomyces,Brettanomyces,Kluyveromyces,Candida或Torula属,优选Saccharomyces属的物种。

10.一种酵母水解物,其基于无盐酵母干物质包含少于100ppm的麸质,优选地少于50ppm的麸质,更优选地少于40ppm、更优选地少于30ppm且更优选地少于20ppm的麸质且至少1ppm的麸质。

11.根据权利要求10所述的酵母水解物,其进一步包含5’-核糖核苷酸。

12.根据权利要求10或权利要求11所述的酵母水解物,其进一步包含5’-GMP和/或5’-IMP。

13.根据权利要求10或权利要求11所述的酵母水解物,其中所述酵母水解物是酵母提取物或酵母自溶物。

14.权利要求10至12中任一项所述的酵母水解物或权利要求13所述的酵母提取物或酵母自溶物在过程风味反应中、在肉类应用中,或在风味增强剂中,或在风味改良剂中,或在头香载体中或在桌面应用品中的用途。

15.一种风味增强剂、一种肉制品、一种风味改良剂、一种头香载体或一种桌面应用品,其包含权利要求10至12中任一项所述的酵母水解物或权利要求13所述的酵母提取物或酵母自溶物。

技术总结
本发明涉及用于制备酵母水解物的方法,该酵母水解物基于无盐酵母干物质包含少于100ppm的麸质且至少1ppm的麸质。

技术研发人员:柏图斯·罗伯图斯·贝伦·范
受保护的技术使用者:帝斯曼知识产权资产管理有限公司
文档号码:201580036242
技术研发日:2015.06.26
技术公布日:2017.05.10

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